Crioconservación de córnea y esclera a -­‐20°C en diferentes especies animales

Abstract

Objetivo: Determinar la viabilidad y la seguridad microbiológica del tejido corneal y escleral canino [c] , felino [f] y equino [e] crioconservado a -20ºC, comparando tejidos crioconservados durante menos de 1 año (G≤1a) con aquellos crioconservados durante largos periodos de tiempo (G≥6a). Materiales y métodos: Treinta y seis globos oculares de perro, 20 de gato, y 34 de caballo se obtuvieron de la Fundació Hospital ClínicVeterinari entre 2003 y 2013. Todos los animales estaban libres de neoplasias o enfermedades infecciosas y no presentaban alteraciones oculares. Tras un protocolo de descontaminación, los ojos se enuclearon en condiciones estériles antes de las 10 horas post-mortem. Los globos se almacenaron a -20ºC en condiciones atmosféricas con un antibiótico de amplio espectro y se mantuvieron a esa temperatura durante diferentes periodos de tiempo hasta su análisis. Se realizaron estudios microbiológicos, histológicos y ultraestructurales, tanto del tejido corneal como del escleral. La microbiología consistió en sembrar las muestras de córnea y esclera en agar sangre, McConkey y Sabouraud, y en caldo de cultivo cerebro-corazón. Histológicamente se evaluaron los artefactos de crioconservación y mediante microscopia electrónica de transmisión se analizó la integridad del colágeno, y se establecieron el número y las características de los queratocitos, clasificándolos en normales, apoptóticos y necróticos. En una selección de muestras caninas se comprobó la muerte celular por apoptosis mediante TUNEL. Resultados. Microbiología: Los cultivos directos de los G≤1afueron positivos en un 27,5% [c], 15,0% [f] y 0% [e] y los de los G≥6a en un 0% [c], 0% [f] y 0% [e]. Los cultivos enriquecidos de los G≤1afueron positivos en un 47,5% [c], 30,0% [f] y 27,5% [e] y los de los G≥6a en un 16,7% [c], 0% [f] y 25,0% [e]. Histopatología:En las tres especies, los artefactos de crioconservación fueron más frecuentes en muestras G≥6a que en G≤1a. MET: El tipo de queratocito predominante fue el apoptótico en todas las muestras de las 3 especies. La estructura del colágeno se conservó a lo largo del tiempo, clasificándose como organizada o semiorganizada en todos los casos, excepto en una muestra de córnea canina. Conclusión. El tejido corneal y escleral canino, felino y equino puede crioconservarse a -20ºC y utilizarse al menos durante 8, 10 y 9 años respectivamente sin impedimentos microbiológicos o estructurales. El paso del tiempo parece reducir la contaminación bacteriana en estos tejidos. La apoptosis es la vía de muerte celular más importante para los queratocitoscriocongelados a -20ºC.

Objective: To determine the viability and microbiological safety of canine [c], feline [f] and equine [e] corneal and scleral tissue cryopreserved at -20°C, comparing tissues cryopreserved for less than 1 year (G≤1a) with those cryopreserved for long periods (G≥6a).

Materials and Methods: Thirty-six eyeballs from dogs, 20 from cats, and 34 from horses were obtained from the Fundació Hospital Clinic Veterinari between 2003 and 2013. All animals were free of neoplasia or infectious diseases and had no ocular abnormalities. After a decontamination protocol, the eyes were enucleated under sterile conditions within 10 hours post-mortem and stored at -20°C under atmospheric conditions with a broad spectrum antibiotic until analysis. Microbiological, histological and ultrastructural studies of both, the scleral and corneal tissue were performed. Microbiology consisted on cultures of corneal and scleral samples on blood, McConkey and Sabouraud agar and brain heart broth. Cryopreservationartefacts were evaluatedby histology. Transmission electron microscopy (TEM) was used to establish collagen integrity, as well asthe number and characteristics of keratocytes, classifying those in normal, apoptotic and necrotic. Cell death by apoptosis was assessed by TUNEL in selected canine samples

Results.Microbiology: Direct cultures were positive in 27.5% [c] 15.0% [f] and 0% [e] of G≤1aand in none of the G≥6a.Enriched cultures were positive in 47.5% [c] 30.0% [f] and 27.5% [e] of G≤1aand in 16.7% [c] 0% [f] and 25.0% [e] ofG≥6a.Histopathology: In all three species, cryopreservation artefacts were more frequent in G≤1a samples than in G≥6a. TEM: The predominant keratocyte was apoptotic in all samples of the 3 species. Collagen structure is retained over time, classified as organized or semi-organized in all cases, except in one sample of canine cornea. Conclusion. The canine, feline and equine corneal and scleral tissues cryopreserved at -20°C can be used for at least 8, 10 and 9 years respectively without microbiological or structural impediments. Bacterial contamination in these tissues seems to be reduced over time. Apoptosis is the most important cell death pathway for cryopreserved (-20º)keratocytes.