Estudi de la reprogramació de cèl·lules acinars a cèl·lules beta mitjançant factors de transcripció

Abstract

La diabetis tipus 1 (T1D) és una malaltia autoimmune causada per la destrucció de les cèl·lules productores d’insulina del pàncrees, les cèl·lules β. La T1D esdevé clínicament aparent quan la majoria de les cèl·lules β han estat destruïdes, i restablir la massa de cèl·lules β per tal de mantenir una homeòstasi adequada de la glucosa és un dels principals reptes de la medicina regenerativa. La generació de noves cèl·lules β a partir de la reprogramació d’altres tipus cel·lulars, com per exemple les cèl·lules acinars, és una nova estratègia terapèutica amb un gran potencial. A més, la reprogramació de cèl·lules acinars comporta certs avantatges respecte la reprogramació d’altres tipus cel·lulars diferenciats, ja que n’hi ha una gran abundància al pàncrees, comparteixen un origen comú amb les cèl·lules β durant l’embriogènesi i resideixen al mateix òrgan que les cèl·lules β. Diversos estudis han descrit que l’expressió mitjançant vectors adenovirals de primera generació (FG-Ad) de Pdx1, Ngn3 i Mafa (PNM), tres factors de transcripció específics de cèl·lula β, en cèl·lules acinars aconsegueix reprogramar aquestes cèl·lules cap a cèl·lules productores d’insulina. No obstant, aquests estudis indiquen que la transducció amb vectors FG-Ad és necessària pel procés de reprogramació, i la funcionalitat de les cèl·lules reprogramades no és exactament igual a la de les cèl·lules β madures. Per tal d’aprofundir en els mecanismes moleculars implicats en la reprogramació de cèl·lules acinars a cèl·lules β, en aquest treball s’ha analitzat la capacitat de reprogramació de tres línies cel·lulars acinars (266-6, AR42J i AR42J-B13) al ser transduïdes amb un vector FG-Ad codificant per PNM. S’ha observat que les tres línies cel·lulars responien de manera molt diferent a la sobreexpressió de PNM, i que la línia cel·lular AR42J-B13 (B13) presentava una eficiència de reprogramació major a les demés línies cel·lulars, evidenciada per una major activació de l’expressió de marcadors de cèl·lula β. En una caracterització més detallada del fenotip de les cèl·lules B13 reprogramades, s’ha pogut observar que aquestes presentaven moltes de les característiques de les cèl·lules β diferenciades adultes, com l’expressió de gens processadors de la pro-insulina, l’expressió dels sensors de la glucosa i la producció de la proteïna de la insulina. No obstant, la insulina produïda per aquestes cèl·lules no era secretada d’una manera eficient i tampoc estava regulada per la glucosa. D’altra banda, s’ha estudiat el paper dels vectors adenovirals en el procés de reprogramació, i s’ha demostrat que la transducció adenoviral per se regula negativament l’expressió de gens exocrins, suggerint que aquests vectors produeixen un efecte de desdiferenciació sobre el fenotip acinar. Amb l’objectiu d’identificar microRNAs involucrats en el procés de reprogramació, s’ha realitzat un estudi del perfil d’expressió de microRNAs. S’ha observat que les cèl·lules AR42J i B13 presentaven patrons d’expressió de microRNAs completament diferenciats, identificant-se fins a 60 microRNAs diferentment expressats entre les dues línies cel·lulars. Les cèl·lules B13 presentaven alguns signes de trobar-se en un estat més indiferenciat que les cèl·lules AR42J, com la supressió de l’expressió de la família de miR-200, fet que podria facilitar la seva reprogramació. També s’han identificat 11 microRNAs involucrats en la transducció adenoviral i 8 microRNAs associats a la sobreexpressió de PNM. En resum, en aquest treball s’ha aprofundit en els mecanismes involucrats en la reprogramació de cèl·lules acinars a cèl·lules β, i s’han identificat microRNAs involucrats en aquest procés, els quals podrien ajudar a millorar l’eficiència de reprogramació cap a cèl·lules β pel tractament de la diabetis mellitus.

Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease caused by the destruction of β cells, the insulin producing cells of the pancreas. T1D becomes clinically detectable when most β cells have been destroyed. Restoring the β cell mass in order to maintain a proper glucose control is one of the major challenges in regenerative medicine. The generation of new β cells from other cell types, such as acinar cells, by cellular reprogramming is a new therapeutic strategy with great potential. Furthermore, the use of acinar cells has several advantages over other differentiated cell types: they share a common embryonic origin with β cells, they are abundant and they are located in the pancreas. Several studies have shown that the expression of Pdx1, Ngn3 and MafA (PNM), three β cell specific transcription factors, using first-generation adenoviral vectors (FG-Ad) in acinar cells is able to reprogram said cells into insulin-producing cells. However, these studies indicate that FG-Ad vector transduction is necessary for the reprogramming process, and the functionality of these reprogrammed cells is not exactly the same as mature β cells. To further investigate the molecular mechanisms involved in the reprogramming of acinar cells into β cells, three acinar cell lines (266-6, AR42J and AR42J-B13) were transduced by a FG-Ad vector expressing PNM. We observed that each cell line responded differently to PNM overexpression, and the greater reprogramming efficiency was observed in the AR42J-B13 (B13) cell line, evidenced by higher activation of β cell markers. In a detailed characterization of the phenotype, it was observed that reprogrammed B13 cells presented many of the characteristics of adult β cells, such as the expression of pro-insulin processing genes and glucose sensors, and the production of mature insulin. However, insulin was not secreted efficiently to the culture media and was not regulated by the glucose levels. The role of adenoviral vectors in the reprogramming process was also studied in this work. We found that adenoviral transduction per se negatively regulated the expression of exocrine genes, thus suggesting that these vectors promote a dedifferentiation effect in the acinar phenotype of B13 cells. To identify microRNAs involved in the reprogramming process, a microRNA screening under different experimental conditions was performed. AR42J and B13 cells presented completely different microRNA expression patterns, and 60 microRNA were identified as differentially expressed comparing both cell lines. B13 cells showed signs of being in a more dedifferentiated state than AR42J cells, such as the suppression of the expression of the miR-200 family, which could facilitate their reprogramming. In addition, 11 microRNAs involved in the adenoviral transduction and 8 microRNAs associated with PNM overexpression have been identified. In summary, in this work we have studied the mechanisms involved in the reprogramming of acinar cells into β cells, and microRNAs involved in this process have been identified. Such miRNAs hold great promise for improving the efficacy of reprogramming acinar cells into β cells for the treatment of diabetes