Aptasensors based on electrochemical impedance spectroscopy

Abstract

En els últims anys, a causa de la necessitat de diàgnostics ràpids i de millores en sensat, s’han utilitzat nous elements de reconeixement en biosensors. Un tipus d’aquests nous elements de reconeixement són els aptàmers. Els aptàmers són cadenes sintètiques de ADN o ARN les quals són seleccionades in vitro i tenen la capacitat d’unir-se a proteïnes, ions, cèl.lules, fàrmacs i lligands de baix pes molecular, reconeixent les seves molècules diana amb alta afinitat i especificitat. Diversos biosensors basats en aptàmers, també anomenats aptasensors, han sigut desenvolupats recentment. D’entre totes les tècniques de transducció utilitzades en biosensors, l’Espectrocòpia Electroquímica d’Impedància ha sigut àmpliament emprada como a eina per caracteritzar la superficies de sensors i estudiar esdeveniments en el biosensat en la superficie d’elèctrodes. La característica més important que presenta aquesta tècnica és que no requereix cap espècie marcada per a la transducció, per tant, aquesta tècnica de detecció pot utilitzar-se per dissenyar protocols de detecció directa sense marcatge, evitant assajos més cars i laboriosos. El principal objectiu d’aquesta tesi doctoral va ser el desenvolupament d’aptasensors utilitzant la tècnica electroquímica d’impedància esmentada anteriorment. Per a això, diferents tipus d’elèctrodes van ser utilitzats, tals com elèctrodes de compòsit grafit-epoxi, elèctrodes de biocompòsit grafit-epoxi modificats amb molècules d’avidina i elèctrodes comercials serigrafiats de nanotubs de carboni de paret múltiple. El treball es va dividir principalmente en dues parts d'acord amb la detecció de dues proteïnes diferents. La primera part es va focalitzar en la detecció de trombina. Primer de tot, es van comparar i avaluar diversos aptasensors de detecció directa sense marcatge basat en diferents tècniques d'immobilització dels aptàmers, tals com: adsorció física humida, afinitat avidina-biotina i enllaç covalent mitjançant activació electroquímica de la superfície de l'elèctrode i mitjançant inserció electroquímica. Posteriorment, els elèctrodes de biocompòsit van ser comparats com a plataformes en genosensat i aptasensat. Amb la finalitat d'amplificar el senyal impedimètric obtingut utilitzant elèctrodes de biocompòsit, un protocol sàndwich va ser emprat incloent nanopartícules d'or modificades amb estreptavidina i tractament amplificador de plata. La segona part de l'estudi es va basar en la detecció de citocrom c. Primerament, es va realitzar un simple aptasensor de detecció directa sense marcatge per a la detecció d'aquesta proteïna utilitzant la tècnica d'immobilització d'adsorció física humida. Finalment, i amb l'objectiu d'amplificar el señal impedimètric, es va desenvolupar un assaig tipus sándwich híbrid d’aptàmer i anticòs utilitzant elèctrodes serigrafiats de nanotubs de carboni de paret múltiple. D'aquesta manera, la tesi explora i compara una àmplia gamma de procediments d'immobilització, l'ús de detecció directa sense marcatge o nanomaterial modificat amb biomolècules en diferents protocols directes o d'amplificació, i l'ús de reconeixement directe i sándwich per amplificar la sensibilitat i/o la selectivitat de l'assaig.

In the recent years, due to the need for rapid diagnosis and improvements in sensing, new recognition elements are employed in biosensors. One kind of these new recognition elements are aptamers. Aptamers are synthetic strands of DNA or RNA which are selected in vitro and have the ability to bind to proteins, ions, whole cells, drugs and low molecular weight ligands recognizing their target with high affinity and specificity. Several aptamer-based biosensors, also called aptasensors, have been recently developed. Among all the transduction techniques employed in biosensors, Electrochemical Impedance Spectroscopy has widely used as a tool for characterizing sensor platforms and for studying biosensing events at the surface of the electrodes. The important feature presented by this technique is that it does not require any labelled species for the transduction; thus, this detection technique can be used for designing label-free protocols thus avoiding more expensive and time-consuming assays. The main aim of this PhD work was the development of aptasensors using the electrochemical impedance technique previously mentioned for protein detection. For that, different types of electrodes were used, such as Graphite Epoxy Composite electrodes (GECs), Avidin Graphite Epoxy Composite electrodes (AvGECs) and commercial Multi-Walled carbon nanotubes screen printed electrodes (MWCNT-SPE). The work was divided in two main parts according to the detection of the two different proteins. The first part was focused on thrombin detection. First of all, different impedimetric label-free aptasensors based on several aptamer immobilization techniques such as wet physical adsorption, avidin-biotin affinity and covalent bond via electrochemical activation of the electrode surface and via electrochemical grafting were developed and evaluated. Then, AvGECs electrodes were compared as a platform for genosensing and aptasensing. With the aim to amplying the obtained impedimetric signal using AvGECs, an aptamer sandwich protocol for thrombin detection was used including streptavidin gold-nanoparticles (Strep-AuNPs) and silver enhancement treatment. The second part of the study was based on cytochrome c detection. Firstly, a simple label-free aptasensor for the detection of this protein using a wet physical adsorption immobilization technique was performed. Finally, with the goal to amplify the impedimetric signal, a hybrid aptamer-antibody sandwich assay using MWCNT-SPE for the detection of the target protein was carried out. In this way, the thesis explores and compares a wide scope of immobilization procedures, the use of label-free or nanocomponent modified biomolecules in different direct or amplified protocols, and the use of direct recognition and sandwich alternatives to enhance sensitivity and/or selectivity of the assay