A shared regulatory network allows functional coupling of Pho89 and Ena1 in response to environmental alkalinization

Abstract

Els microorganismes estan exposats a canvis en l’ambient que poden implicar una situació d’estrès. El llevat Saccharomyces cerevisiae prefereix condicions acides per proliferar; per tant, l’alcalinització del medi extern li empitjora el creixement. Per superar aquest estrès, el llevat activa diverses vies de senyalització que conformen una complexa xarxa reguladora, provocant un remodelament transcripcional. La via de la calcineurina, activada per l’increment de calci citosòlic en condicions alcalines, governa l’expressió gènica a través del factor de transcripció Crz1. Un estrès alcalí és detectat per la proteïna transmembrana Rim21, un component de la via Rim101, que desencadena una cascada de senyalització provocant l’activació per proteòlisi de Rim101. Aquest factor de transcripció reprimeix l’expressió de NRG1, un altre repressor transcripcional, induint així l’expressió de determinats gens indirectament. La quinasa Snf1 també s’activa per estrès alcalí i té varies dianes a través de les quals controla diferents processos. Entre aquestes, Snf1 inhibeix els repressors Mig1/Mig2 i Nrg1/Nrg2, alleugerint la repressió d’un grup divers de gens. Addicionalment, un increment del pH extern activa la via de senyalització PHO, relacionada amb l’escassetat de fosfat, provocant la inactivació del complex Pho80-Pho85 i la subseqüent acumulació de Pho4 al nucli. Aquest factor de transcripció, conjuntament amb Pho2, és responsable de l’expressió del reguló PHO, la funció del qual és mantenir els nivells de fosfat intracel·lular. El gen ENA1, que codifica una Na+-ATPasa, és un clar exemple de coregulació per diferents vies de senyalització. La seva inducció alcalina depèn de Crz1 i de l’alliberament de la repressió de Nrg1, Mig i Mig2, els quals son inhibits per Rim101 i Snf1. Pho89 és un cotransportador de sodi/fosfat d’alta afinitat membre del reguló PHO. Apart de ser induït per Pho4, sota condicions alcalines l’expressió de PHO89 també depèn de Crz1, sent l’únic gen del reguló PHO que mostra aquesta regulació. En aquest treball ens centrem en la xarxa reguladora que controla la inducció alcalina de PHO89 i el seu possible paper en la resposta a aquest estrès. Mostrem com l’expressió de PHO89 en condicions d’escassetat de fosfat és més feble i retardada en comparació amb l’expressió a pH bàsic. Per altra banda, l’expressió de Pho84, l’altre transportador de fosfat d’alta afinitat, és més potent en condicions de baix fosfat que en condicions d’estrès alcalí. L’efecte de la via de la calcineurina sobre PHO89 es produeix exclusivament a través de Crz1, i aquest factor de transcripció s’uneix al seu promotor poc després de l’estrès alcalí. La via Rim101 també indueix PHO89 en condicions de pH bàsic a través de NRG1. En condicions alcalines, la quinasa Snf1 és fosforilada i és responsable de la fosforilació dels repressors Mig1 i Mig2, que surten del nucli. Tot i això, només Mig2 té un paper rellevant en la repressió de PHO89. A més a més, la mutació reg1, que presenta una Snf1 hiperactiva, provoca un increment dels nivells de PHO89 al llarg del temps. En aquest treball també mostrem la possible relació entre Pho89 i Ena1 en un ambient alcalí. Tots dos gens comparteixen els mateixos factors reguladors que permeten la seva expressió sincrònica després d’un estrès per pH bàsic. Quan l’adquisició de fosfat depèn exclusivament de Pho89, l’absència de ENA1 confereix un fort fenotip de sensibilitat a pH alcalí. En aquesta mateixa situació, les cèl·lules presenten un increment substancial en la concentració de sodi intracel·lular, suggerint que aquesta pot ser la causa dels seus problemes de creixement. Aquests resultats indiquen que la coregulació entre Ena1 i Pho89 permetria el seu acoblament funcional, ja que la capacitat per expulsar sodi de Ena1 serviria de mecanisme de detoxificació, permetent un continu cotransport Na+/Pi en condicions alcalines.

Microorganisms are exposed to slight changes in the environment, which may imply a stressful situation. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae prefers acidic conditions to proliferate; hence, an alkalinization of the external medium impairs its growth. To cope with this stress, S. cerevisiae activates several signaling pathways that create a complex regulatory network, leading to a profound remodeling of the transcriptional profile. The calcineurin pathway, activated by an increase of cytosolic calcium occurring in alkaline conditions, governs gene expression through the transcription factor Crz1. Moreover, high pH stress is sensed by the transmembrane protein Rim21, a component of the Rim101 pathway, which starts a signaling cascade resulting in the proteolytic activation of Rim101. This transcription factor represses the expression of NRG1, another transcriptional repressor, thus indirectly inducing the expression of certain genes. The Snf1 kinase is also activated by alkaline stress and has several targets through which it controls different processes. Among them, Snf1 inhibits the repressors Mig1/Mig2 and Nrg1/Nrg2, alleviating the repression of a diverse group of genes. Furthermore, an increase of the external pH also triggers the PHO signaling pathway, related to phosphate scarcity, causing the inactivation of the Pho80-Pho85 complex and the subsequent accumulation of Pho4 into the nucleus. This transcription factor, along with Pho2, is responsible for the expression of the PHO regulon, the function of which is to maintain the intracellular phosphate pool. The Na+-ATPase-encoding gene ENA1 is an excellent example of coregulation by different signaling pathways. The alkaline induction of this gene depends on Crz1 and on release from the repression by Nrg1, Mig1, and Mig2, triggered by activation of Rim101 and Snf1. Pho89 is a high-affinity sodium/phosphate cotransporter belonging to the PHO regulon. Apart from being upregulated by Pho4, under alkaline conditions PHO89 expression is also dependent on Crz1, being the only PHO gene to display such regulation. In this work we focus on the regulatory network driving the alkaline induction of PHO89 and its possible role in the high pH stress response. We show that the transcriptional profiles of PHO89 between alkaline and phosphate starvation conditions differ considerably, with a much weaker and delayed expression on the latter. In contrast, the expression of Pho84, the other high-affinity phosphate transporter, is stronger in low phosphate conditions than under alkaline stress. The calcineurin effect on PHO89 is mediated exclusively through Crz1, and this transcription factor is bound to its promoter shortly after the alkaline induction. The Rim101 pathway also upregulates PHO89 during high pH stress by impinging on NRG1. After the alkaline stress, the Snf1 kinase is phosphorylated and mediates the phosphorylation of the repressors Mig1 and Mig2, which exit the nucleus under these same conditions. However, only Mig2 has a relevant role in repressing PHO89. Furthermore, the reg1 mutation, which leads to a hyperactive Snf1, results in increased Pho89 levels over time, indicating the importance of Snf1 in the alkaline expression of this transporter. In this study we also show the putative relationship between Pho89 and Ena1 in an alkaline environment. Both genes share several regulatory factors which allow their synchronous expression after high pH stress. Interestingly, when cells rely exclusively on Pho89 for phosphate uptake, the absence of ENA1 confers a strong alkali-sensitive phenotype. In this same situation, cells display a substantial increase in their intracellular sodium concentration, suggesting that this might be the cause of impaired growth. These results point towards the idea that the coregulation exhibited by Ena1 and Pho89 could allow their functional coupling, and that the Na+ extrusion ability of Ena1 could serve as a detoxifying mechanism necessary to support continuous Pho89 Na+/Pi cotransport under alkaline conditions.