Diseño y caracterización de péptidos específicamente dirigidos al bloqueo de la formación del apresorio en el hongo fitopatógeno Magnaporthe oryzae

Abstract

La piriculariosis del arroz, causada por el hongo Magnaporthe oryzae, es la enfermedad que más pérdidas genera devastando miles de hectáreas de cultivo anualmente. Los tratamientos antifúngicos frente a esta enfermedad suelen ser de poca utilidad y se vuelven ineficaces en poco tiempo debido a la alta tasa de variación del hongo. Además, dentro del contexto legislativo actual a nivel europeo, se está restringiendo cada vez más la utilización de compuestos antifúngicos de amplio espectro debido a los posibles daños que pueden ocasionar sobre el ecosistema y la salud humana. Una alternativa prometedora al uso de los antifúngicos convencionales son los péptidos antimicrobianos, y más concretamente los péptidos dirigidos capaces de bloquear un proceso esencial para la infección del patógeno. Un paso fundamental en el proceso infectivo del hongo M. oryzae es la formación del apresorio, cuya finalidad es romper la superficie foliar y así penetrar en el mesófilo de la hoja. El desarrollo de compuestos capaces de bloquear específicamente este proceso sin afectar al ciclo vital del hongo constituiría una estrategia ventajosa en el control de la piriculariosis, a priori no tóxica para otros organismos incluido el ser humano. En este trabajo, hemos abordado este objetivo mediante dos aproximaciones, el cribado de una biblioteca combinatoria de péptidos y la modificación de secuencias de AMPs naturales mediante diseño racional. Gracias al conocimiento que se tiene sobre la secuencia y el modo de acción de los péptidos antimicrobianos, hemos diseñado una serie de péptidos capaces de controlar el desarrollo de la piriculariosis mediante inhibición específica de la formación del apresorio en M. oryzae, pero sin afectar a la viabilidad celular. Nuestros resultados indican que péptidos pequeños, como el heptapéptido PAF104, son capaces de reprimir la expresión de los genes MoMSB2 y MoMST11, implicados en la ruta de señalización de la MAPK Pmk1 imprescindible para la formación del apresorio en M. oryzae. Además, demostramos un comportamiento diferencial frente a distintas estructuras infectivas (i.e., apresorio, estructuras similares al apresorio e hifopodios), lo que apoya la idea propuesta por otros investigadores de que los mecanismos moleculares que regulan estás estructuras no son exactamente iguales. Mediante microscopía confocal mostramos que el tratamiento del hongo con MgAPI16 da lugar a apresorios aberrantes y no funcionales. En conclusión la principal aportación de esta investigación es el diseño de una serie de péptidos sintéticos, los heptapéptidos diseñados de novo PAF104, MgAPI24, MgAPI40 y MgAPI47, y el péptido MgAPI16 derivado del péptido antimicrobiano natural CecA, capaces de controlar el desarrollo de la piriculariosis en arroz mediante la inhibición específica de la formación del apresorio. Este trabajo contribuye por tanto al diseño de estrategias de control en protección vegetal basadas en péptidos dirigidos, las cuales deberían ser sostenibles y respetuosas con el medio ambiente.

Rice blast caused by the fungus Magnaporthe oryzae is the most devastating rice disease, causing losses and ravaging thousands of hectares every year. Antifungal treatments are often ineffective and become useless soon due to the high fungus variation rate. Furthermore, within the current legislative framework at European level, it is increasingly restricting the use of broad-spectrum antifungal compounds because of the potential damage that can cause to the ecosystem and human health. One promising alternative to conventional antifungal compounds are the use of antimicrobial peptides, and in particular the target-orientated peptides able to block an essential infective process. A basic step on the development of rice blast diseases is the formation of appressoria, necessary to break the leaf surface and penetrate the mesophyll. To develop novel compounds able to block this process without affecting the life cycle of the fungus could be a promising alternative to control rice blast diseases, a priori no toxic to other organisms including humans. In this work, we board this objective by performing two approaches, the screening of a peptide combinatorial library and the rational design of natural known antimicrobial peptides. We have design a set of peptides able to control the infection caused by M. oryzae by specific inhibition of appressorium formation, but without a lytic effect. Our results show that small peptides, such as the heptapeptide PAF104, represses the gene expression of MoMSB2 and MoMST11, involved in the Pmk1 MAPK pathway essential to M. oryzae appressorium formation. Moreover, the designed peptides showed a differential effect on some infective structures (i.e., appressoria, appressorium-like structures and hyphopodia), supporting that the molecular regulation of these structures is different, an idea previously proposed by other researchers. By confocal microscopy we showed that the appressoria treated with MgAPI16 present aberrant physical and not functional structures. As a conclusion, the main contribution of this work is the design of a set of synthetic peptides, de novo designed heptapeptides PAF104, MgAPI24, MgAPI40 y MgAPI47 and the peptide MgAPI16 derived from the natural antimicrobial peptide Cecropin A, which are able to control rice blast development through the specific inhibition of the appressorium formation in M. oryzae. Therefore, this work contributes to the design of novel strategies based in targeted-orientated peptides for plant protection, which should be environmentally friendly.