Detección e Identificación de los virus del papiloma humano. Caracterización de dos nuevas variantes

Abstract

Los Papilomavirus Humanos (VPHs) son virus que causan enfermedades proliferativas en el epitelio de piel y mucosas. Su relación con el cáncer de cuello de útero se conoce desde la década de los 70 y actualmente está ampliamente aceptado que los papilomavirus humanos son el único agente etiológico causante del cáncer cervical. Constituyen un grupo de virus muy heterogéneo, dentro del cual destacan por cuestiones de tipo clínico algunos genotipos que presentan un alto potencial oncogénico y que son los causantes de la mayoría de los carcinomas invasores de cérvix. Se han desarrollado vacunas contra algunos de estos genotipos, y actualmente se están incluyendo en los programas nacionales de vacunación de un gran número de países. La tesis describe un trabajo de investigación que ha aportado tres aspectos novedosos que se presentan en los tres capítulos en los que está estructurada. En el primer capítulo se describe un nuevo sistema de detección e identificación de papilomavirus humanos de amplio espectro. El método está basado en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y en RFLPs (análisis de fragmentos de restricción). Permite la identificación de los genotipos víricos presentes en las muestras clínicas con lesiones precursoras de cáncer de cuello de útero. De esta forma permite valorar el potencial evolutivo de las lesiones pre-cancerosas, ya que cada genotipo vírico presenta un nivel de riesgo específico. Asimismo, el método incorpora un mecanismo molecular desarrollado especialmente para el presente trabajo que permite detectar las eventuales inhibiciones de las reacciones de amplificación. En el segundo capítulo se describe la utilización del método presentado, para el estudio de 9.734 muestras clínicas procedentes de varios hospitales y centros sanitarios españoles. Se esta forma se consiguió detectar e identificar el genotipo vírico en un gran número de muestras y obtener información estadísticamente significativa respecto a la distribución de los diferentes genotipos en la población. También se estudió la relación entre la gravedad de la lesión y la edad con el genotipo presente en la muestra. En el tercer capítulo se describe el trabajo de caracterización de dos nuevas variantes detectadas con el método presentado en el primer capítulo. Este sistema de identificación permite la detección de un gran número de genotipos conocidos de papilomavirus, así como de variantes no descritas previamente. Esto permitió la detección de dos nuevos genotipos, que fueron secuenciados completamente y clasificados taxonómicamente como dos nuevos subtipos de tipos actualmente conocidos. En la presente tesis se ha desarrollado un sistema de detección e identificación de papilomavirus que ha sido comercializado como un producto para diagnóstico in vitro. Por otro lado, este sistema también ha sido comercializado como un servicio de laboratorio, consistente en la realización de una prueba y la emisión de un informe clínico. En total se han podido analizar aproximadamente unas 26.000 muestras clínicas utilizando este sistema El aspecto más destacado de este trabajo de tesis es el desarrollo de un sistema de detección e identificación de papilomavirus y su demostrada aplicabilidad clínica, así como su utilidad como método para la realización de estudios estadísticos sobre la distribución de genotipos víricos.

The Human Papillomaviruses (HPVs) cause proliferative diseases in the epithelium of skin and mucous membranes. The relationship between them and cervical cancer has been known since the early ‘70s and now is widely accepted that human papillomaviruses are the only etiologic agent of cervical cancer. They are a very heterogeneous group of viruses. Some of them are very important so have a high oncogenic potential and they are responsible for most invasive cervical carcinomas. It has been developed vaccines against some of these genotypes, and currently are used in national immunization programs of many countries. The thesis describes a research project which has provided three new issues that arise in the three chapters in which it is structured. In the first chapter it is described a new system of detection and identification of human papillomavirus of broad spectrum. The system is based on PCR (polymerase chain reaction) and RFLPs (restriction fragment length polymorphism). It allows the identification of the viral genotypes present in clinical samples with precursor lesions of cervical cancer. Thus, it allows to assess the potential of the evolution of pre-cancerous lesions, because each viral genotype has a specific level of risk. Further, the method includes a molecular mechanism specially developed for this project to detect the eventual inhibition of the amplification reactions. In the second chapter it is described the utilization of the presented method to the analysis of 9.734 clinical samples from several hospitals and Spanish health centers. Thus, it was possible to detect and identify the viral genotype of a large number of samples and to obtain statistically significant information regarding the distribution of the different genotypes in the population. It was also studied the relation between the severity of the lesion and the age with the genotype present in the sample. In the third chapter it is described the project of the characterization of two new variants detected with the method presented in the first chapter. This identification method allows the detection of many papillomavirus of known genotype as well as variants not described previuosly. This allowed the detection of two new genotypes, which were completely sequenced and taxonomically classified as two new subtypes of the currently known types. In the present thesis it has been developed an identification and detection system of papillomavirus which has been commercialized as an in vitro diagnostic product. On the other hand, this system has also been commercialized as a laboratory service, consisting in the realization of a test and the emission of a clinical report. In total, it has been able to analyze about 26.000 clinical samples using this system. The highlight of this thesis is the development of an identification and detection system of papillomavirus and its proved clinical applicability, as well as its utility as a method for the realization of statistics studies about the distribution of viral genotypes.