Utilización de glicerol proveniente de la industria de biodiesel como fuente de carbono para la producción de lipasas recombinantes en Pichia pastoris.

Abstract

En este trabajo se recogen los resultados obtenidos en el estudio de la producción extracelular de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura metilotrófica Pichia pastoris bajo el PAOX1, utilizando una estrategia de alimentación con sustratos mixtos en la etapa de inducción para cultivos semicontinuos, con el fin de evaluar la viabilidad del uso del glicerol crudo como cosustrato en la producción de la lipasa para su posterior uso en la producción enzimática de biodiesel. En primer lugar se consideró la valorización del glicerol crudo obtenido a partir de aceites vegetales naturales y reciclados en la producción de biodiesel como una fuente de carbono para el crecimiento celular y la producción de la ROL. Se concluyó que en los procesos fermentativos con P. pastoris la utilización de glicerol crudo permite el crecimiento de la levadura y además no se evidencia un efecto negativo al utilizar glicerol crudo proveniente de la producción de biodiesel, en términos de rendimiento y velocidad específica de crecimiento. El sistema de expresión de la ROL en P. pastoris utilizando el PAOX1 depende de la utilización del metanol como sustrato inductor. En este trabajo se probaron diversas estrategias de adición de sustratos mixtos en cultivos semicontinuos para evaluar la producción de la proteína recombinante bajo este sistema de expresión. En primera instancia se llevó a cabo una alimentación mixta adicionando pulsos de metanol y alimentación exponencial con un cosustrato (glicerol). En el ensayo inicial, se alimentó con metanol como única fuente utilizando pulsos de metanol. Los resultados muestran que la estrategia de adición de metanol como único sustrato cada 12 horas mediante pulsos, resulta negativo tanto para el crecimiento como para la producción del producto heterólogo. En ensayos posteriores se realizaron cultivos en semicontinuo con una estrategia de alimentación mixta utilizando dos velocidades específicas de crecimiento con adición exponencial preprogramada de glicerol (0.1 y 0.02 h-1) y pulsos de metanol a dos concentraciones (10 y 5 g/L) adicionados a diferentes periodos de tiempo (1, 2, 6, y 12 h). Al utilizar una μ de glicerol de 0.1 h-1 el consumo de metanol se ve afectado, evidenciándose una clara represión del PAOX1. La concentración de los pulsos de metanol y su frecuencia tienen una influencia significativa en la producción del producto heterólogo. Posteriormente, se realizó una alimentación manteniendo fija la concentración de metanol (1.5 y 2 g/L) y el cosustrato siguiendo una alimentación preprogramada para una velocidad específica de crecimiento constante (0.02 h-1 y 0.05 h-1), Los resultados obtenidos mostraron que la producción de ROL en P. pastoris no es comparable entre las cepas Mut+ y Muts, aunque se empleen estrategias de cultivo similares. La presencia del glicerol como cosustrato no mejora la producción, ni la velocidad específica de producción. En las últimas estrategias, se planteó la utilización de sustratos mixtos en una alimentación exponencial preprogramada de glicerol a 0.02 y 0.04 h-1 con metanol para una velocidad específica de crecimiento de 0.02 h-1, y se realizó una comparación utilizando como cosustrato sorbitol a una velocidad de crecimiento de 0.02 h-1 con metanol para la misma velocidad específica de crecimiento. Se observa que el comportamiento de la cepa con sustratos mixtos glicerol y sorbitol a nivel de rendimiento Yp/x y productividad volumétrica presenta un comportamiento parecido al reportado cuando se utiliza metanol como única fuente de carbono. Los resultados de la velocidad específica de consumo de metanol son iguales cuando se utiliza metanol como única fuente de carbono y cuando se utiliza sorbitol como cosustrato, lo que muestra que el sorbitol no ejerce acciones represoras sobre el promotor PAOX1, contrario a lo observado cuando se utiliza glicerol como cosustrato donde el consumo de metanol disminuye 2.6 veces; mostrándose que, a pesar de encontrarse en condiciones limitantes el glicerol reprime al promotor PAOX1. Al utilizar glicerol y metanol como cosustratos se observa un aumento significativo de la actividad proteolítica independientemente de la velocidad específica de crecimiento sobre glicerol, lo que no se observó al utilizar sorbitol como cosustrato. Los niveles de biomasa alcanzados en los cultivos con glicerol como cosustrato son mayores que los alcanzados con sorbitol, por lo que puede ser que haya un mayor efecto de lisis celular en los cultivos con glicerol de forma que se recuperan más contaminantes en el producto final, sobre todo en etapas avanzadas del cultivo, ocasionando una disminución en la actividad específica de la proteína recombinante.

In this work the results obtained in the study of the production of extracellular lipase of Rhizopus oryzae (ROL) expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under the PAOX1, using a strategy of feeding mixed substrates in the induction stage in semi-continuous cultures are shown. Firstly, the valorization of crude glycerol obtained from natural and recycled vegetable oils in the biodiesel production as a carbon source for cell growth and production of ROL was evaluated. It was concluded that in fermentation processes with P. pastoris using crude glycerol allows the growth of yeast and no negative effect is observed in terms of yield and specific growth rate. The ROL expression system in P. pastoris using the PAOX1 depends on the use of methanol as the inductor substrate. In this work various strategies are tested to evaluate the use of mixed substrates for the production of recombinant protein under this expression system. Preliminarly, it is carried out by adding pulses of methanol and following an exponential feeding of the co-substrate (glycerol). The results show that the strategy of adding methanol pulses as the sole substrate every 12 hours is negative for both, cell growth and production of heterologous product. In subsequent fermentations, semi-continuous cultures using two specific growth rates with preprogrammed exponential addition of glycerol (0.1 and 0.02 h-1) and methanol pulses at two concentrations (10 and 5 g/L) added at different time periods (1, 2, 6, and 12 h) were performed 0.1 h-1 glycerolmethanol consumption is affected, showing a clear repression of PAOX1. The concentration of the methanol pulses and its frequency has a significant influence on the production of the heterologous product. Subsequently, a different strategy was performed by maintaining the methanol concentration (1.5 and 2 g/L) and the co-substrate following a preprogrammed feeding with constant specific growth rate (0.02 h-1 and 0.05 h-1) The results have shown that the production of ROL in P. pastoris is not comparable between the Mut+ and Muts similar strains though cultivation strategies are employed. The presence of glycerol as co-substrate production does not improve the production, and the specific production rate. Finally, the use of mixed substrates was carried out using combined preset exponential feeding of glycerol (0.02 h-1 and 0.04 h-1) with methanol addition for a specific growth rate of 0.02 h-1. A comparison was made with the use of sorbitol as co-substrate at specific growth rate of 0.02 h-1 with methanol addition to let the same specific growth rate. It is noted the the values of Yp/x and volumetric productivity when glycerol and sorbitol are used as mixed substrates are very similar than reported when methanol is used as sole carbon source. The results of the specific rate of methanol consumption are equivalent when methanol is used as sole carbon source and when sorbitol is used as co-substrate, which shows that the sorbitol do not exerts repressive action on the PAOX1 promoter, contrary to what was observed when using glycerol as co-substrate where methanol consumption decreases 2.6 times; stating that, despite being in limiting conditions glycerol PAOX1 represses the promoter. Additionally, by using methanol and glycerol as co-substrates a significant increase in the proteolytic activity regardless of the specific growth rate of glycerol is observed. However, this fact was not observed when using sorbitol as co-substrate. Biomass levels achieved in cultures with glycerol as co-substrate are greater than those obtained with sorbitol, which might led to a greater cell lyses process and so, more contaminants in the final product, specially in later culture steps, causing a decrease in the specific activity of the recombinant protein.