Valorización de residuos agroindustriales para la obtención de liquenisina por Bacillus licheniformis AL 1.1

Abstract

La cepa bacteriana AL 1.1 se aisló de una muestra de suelo de la isla Decepción del continente Antártico. Inicialmente se observó que dicha cepa tenía la capacidad de reducir la tensión superficial del medio, por lo que fue seleccionada para realizar la presente tesis doctoral.

Después de confirmar la identificación del aislado como un Bacillus licheniformis se caracterizó el biotensioactivo (BT) producido como liquenisina (LchAL1.1). El estudio de las propiedades físico-químicas de la LchAL1.1 mostró que es capaz de reducir la tensión superficial del agua de 72 a 30 mN/m y posee una concentración micelar crítica de 15 mg/L, indicando una elevada eficacia y eficiencia. La LchAL1.1 tiene la capacidad de formar cristales líquidos del tipo de cruces de malta, lo cual sugiere una importante capacidad de agregación y abre un campo importante en la encapsulación de compuestos de interés.

La primera parte del trabajo se centró en el estudio de la producción del BT. Al analizarse diversas fuentes de carbono se observó que la cepa AL 1.1 solo producía liquenisina con hidratos de carbono. Dicha información fue de utilidad para la selección de las melazas como fuente de carbono ya que es un sustrato rico en dichos componentes y además es una fuente residual de bajo coste. Utilizando dicho sustrato se diseñó el medio de producción óptimo mediante la aplicación de la metodología de superficie de respuesta (107,82 g/L de melazas, 6,47 g/L de NaNO3 y 9,7 g/L de K2HPO4/KH2PO4), obteniendo rendimientos cercanos a los 3,2 g/L de liquenisina, lo que representa un incremento de 15 veces con respecto al medio inicial.

Se han estudiado las propiedades biológicas de la LchAL1.1 para conocer su posible aplicación en diferentes ámbitos. A pesar de su débil acción antimicrobiana, la LchAL1.1 se presenta como una alternativa interesante para evitar la adherencia y eliminación de biofilms microbianos, encontrando una mayor eficacia para evitar la adherencia microbiana y una alta eficiencia para la eliminación del biofilm pre-formado. Adicionalmente se estudió la interacción de la LchAL1.1 con membranas biológicas y vesículas fosfolipídicas con el objetivo de conocer el mecanismo molecular de su acción. La LchAL1.1 produce hemólisis a concentraciones por debajo de su concentración micelar crítica. Las medidas cinéticas muestran que con la adición de la LchAL1.1, la salida de K+ precede a la de la hemoglobina, y que la adición de protectores osmóticos de tamaño apropiado al medio externo hace posible disminuir y hasta evitar la hemólisis. Estos resultados sugieren que la hemólisis de los eritrocitos humanos ocurre por un proceso coloide-osmótico. Por otro lado, la adición de la LchAL1.1 a vesículas unilamelares (LUV) de POPC produce la salida selectiva de solutos atrapados en su interior al medio externo, encontrando que la composición de la membrana modula el proceso de salida en gran medida. Esto nos indica que la incorporación de la LchAL1.1 en membranas tanto experimentales como modelos, provoca la formación de dominios laterales, los cuales forman defectos o “poros” a través de los cuales tiene lugar la salida de solutos con un tamaño determinado. Con respecto a su acción sobre células eucariotas, la liquenisina induce apoptosis en un 96,5% de las células epiteliales de cáncer de colón (Caco-2). Dicho efecto puede estar relacionado con la interacción de las micelas con la bicapa lipídica, ya que el efecto ocurre a concentraciones de la LchAL1.1 que están por encima de su concentración micelar crítica (50 – 100 µg/mL).

Un nuevo enfoque para potenciar las propiedades biológicas de los compuestos bioactivos, es la posibilidad de utilizarlos en combinación. En este sentido, se evaluó la interacción de la LchAL1.1 con tensioactivos sintéticos geminales derivados de aminoácidos como el C3(LA)2 y C6(LL)2, encontrando que con el C3(LA)2 se produce una respuesta sinérgica en sus propiedades antimicrobianas, mejorando la acción de ambos compuestos especialmente contra bacterias Gram negativas

Biosurfactants are of great interest due to the demand for natural products with low toxicity. Strain AL 1.1, isolated on Deception Island (Antarctica) and identified as Bacillus licheniformis, produce lipopeptide when grow under a variety of carbohydrates. The lipopeptide was characterised as lichenysin (LchAL1.1). The LchAL1.1 reduced surface tension to 30 mN/m and had a critical micelle concentration of 15 mg/L. This highly effective and efficient characterized the product as a powerful surfactant. Besides, the formation of liquid crystalline by LchAL1.1 in form of Maltese crosses was revealed. This suggested important properties to self-aggregate and opens an important field in the compounds encapsulation.

Nevertheless, their production is not competitive when cost is a limiting factor. For this reason, an economical medium, containing molasses, was optimized to enhance lichenysin production by response surface methodology (RSM). A production of 3.2 g l-1 of lichenysin was achieved with an optimum medium containing 107.82 g l-1 of molasses, 6.47 g l-1 of NaNO3 and 9.7 g l-1 of K2HPO4/KH2PO4, in which, molasses and phosphate salts had a significant effect on biosurfactant production. This medium resulted in a fifteen times increase in production compared with the non-optimized medium.

The LchAL1.1 showed a weak antimicrobial activity, however, it had notable anti-adhesion activity, and was able to prevent and eliminate the biofilm formation by pathogenic strains associated with foodborne illness. Lychenysin was effectively applied in a surface pre-treatment to avoid microbial biofilm. It was also very efficient in removing biofilms in surface post-treatment. In addition, the molecular mechanism underlying permeabilization of model and biological membranes by the lipopeptide lichenysin was evaluated. The LchAL1.1 caused hemolysis of human erythrocytes, which varied with LchAL1.1 concentration in a sigmoidal manner. The LchAL1.1-induced K+ release from red blood cells preceded the leakage of hemoglobin, and in addition, hemolysis could be impeded by the presence of compounds in the external medium having a size larger than PEG 4000, indicating a colloid-osmotic mechanism for hemolysis. Lichenysin also caused permeabilization of model phospholipid membranes, as monitored by the release of carboxyfluorescein, from large unilamellar vesicles (LUV). Lipid membrane composition plays a role in the target membrane selectivity of lichenysin. The experimental results support a pore-type behaviour that can be explained by the formation of enhanced permeability domains in the erythrocyte membrane, as observed in model membranes. Furthermore, the LchAL1.1 induced apoptosis in non-differentiated intestinal Caco-2 cells (96.5%). The action can be due to the micelles interaction with lipid bilayer, because the effect occurred to LchAL1.1 concentration above critical micelle concentration (50-100 µg ml-1).

Finally, the interaction between lichenysin, arginine (C3(LA)2) and lysine (C6(LL)2) surfactants was evaluated. Thus, when the LchAL1.1 act as co-surfactant improved the antimicrobial activity of arginine (C3(LA)2) surfactant, showing a synergistic effect, mainly in front to Gram negatives bacteria.