Unravelling the role of zinc in the resistance to necrotrophic fungi in arabidopsis thaliana and noccaea caerulescens

Abstract

El zinc es un micronutriente esencial para las plantas, pero tóxico a concentraciones elevadas. La mayoría de las plantas adaptadas a suelos metalíferos excluyen el exceso de metales de sus tejidos. Sin embargo, algunas plantas denominadas hiperacumuladoras toleran y acumulan en parte aérea concentraciones de metales extremadamente altas. Una de las hipótesis más aceptadas que explica la adquisición de este rasgo relaciona una elevada concentración de metales con una mayor resistencia a patógenos y herbívoros (hipótesis de la defensa metálica). De hecho, existen evidencias de que altas concentraciones de metal en planta pueden ser tóxicas para microorganismos fitopatógenos (hipótesis de la defensa elemental), incluso a niveles por debajo del umbral de hiperacumulación (hipótesis de la mejora defensiva). No obstante, el Zn podría sobre o subregular compuestos orgánicos relacionados con el sistema inmune de la planta, acentuando la respuesta al estrés (hipótesis de los efectos conjuntos) o ahorrando costes metabólicos (hipótesis de la compensación). En esta tesis se examinó la hipótesis de la defensa metálica en plantas hiperacumuladoras y no hiperacumuladoras inoculadas con hongos necrotróficos. Para ello se consideraron el efecto directo tóxico del Zn y la interacción con las defensas orgánicas, estableciéndose tres patosistemas con plantas creciendo en distintas concentraciones de Zn: Noccaea caerulescens inoculada con Alternaria brassicicola y Arabidopsis thaliana inoculada con Alternaria o Botrytis cinerea. En el caso de Arabidopsis, se emplearon cuatro mutantes con defectos metabólicos en la respuesta al estrés: npr1, pad1, coi1 y etr1. Además, se localizaron en los Pirineos poblaciones naturales de plantas del género Noccaea, que fueron identificadas y caracterizadas con vista a futuros experimentos de campo. El Zn mejoró la resistencia de Noccaea a Alternaria, y se correlacionó negativamente con algunas de las defensas orgánicas. A pesar de que el SA, JA, ABA y las expresiones de varios genes marcadores de las rutas del SA, JA y JA/Et fueron inducidos por igual 24 horas tras la inoculación con Alternaria, una semana más tarde el Zn y las rutas de señalización de estrés se correlacionaron negativamente. Asimismo, se encontró una compensación entre el Zn y los glucosinolatos en hoja, pero, por el contrario, una semana después de la inoculación con Alternaria la concentración de glucosinolatos se vio incrementada en las hojas infectadas con mayor concentración de Zn. Las plantas de A. thaliana silvestres tratadas con Zn fueron más resistentes a Alternaria, pero no claramente a Botrytis. Arabidopsis silvestre y los mutantes de las rutas de señalización de estrés acumularon concentraciones similares de Zn en hoja, descritas como tóxicas para Alternaria, pero no para Botrytis. El Zn amplificó la expresión de los genes relacionados con las rutas de señalización del SA y del JA/Et en respuesta a la infección por Alternaria. Sin embargo, los cambios en las concentraciones de SA, JA, ABA y ACC no fueron responsables de las diferencias en la resistencia a Alternaria. Los mutantes tratados con Zn no fueron más resistentes a ninguno de los patógenos o incluso más susceptibles a Botrytis. Como el Zn no compensó su defecto metabólico, se sugiere que las defensas orgánicas activadas por el Zn tuvieron un papel más importante contra Alternaria que el Zn como defensa inorgánica. Las plantas de tres poblaciones de suelos no metalíferos de los Pirineos hiperacumularon Zn y Cd y fueron identificadas como Noccaea brachypetala según características morfológicas. Además, creciendo en hidroponía, presentaron diferencias fenotípicas, lo cual sugiere que existen diferencias genéticas subyacentes puestas de manifiesto en la expresión de genes de trasportadores de metales en respuesta a Zn y Cd exógenos. El uso de estas poblaciones para estudios de campo se ve limitado por su fragilidad y dificultad de acceso.

Zinc is an essential plant micronutrient but it can be toxic in elevated concentrations. Most of the plants adapted to metalliferous soils exclude metals from their tissues. However, some plants so-called hyperaccumulators are able to tolerate and accumulate extremely high metal concentrations in their shoots. Among the most accepted hypothesis to explain the acquisition of this trait is that heavy metals protect the plant against pathogens and herbivores (metal defense hypothesis). In fact, Zn and other heavy metals may be toxic for the attacking pathogens at high concentration in plant (elemental defense hypothesis). Metals have been accounted even for improving plant disease resistance below hyperaccumulation levels, thus being a possible explanation for the acquisition of the trait (defensive enhancement hypothesis). Nonetheless, other organic compounds related to the plant immune system, have been reported to be up or under regulated in response to Zn, thus enhancing the stress response (joint effects hypothesis) or saving metabolic cost to the plant (trade-off hypothesis). In this thesis the metal defense hypothesis was tested in metal and non-metal hyperaccumulating species inoculated with necrotrophic fungi. Both direct metal toxicity and indirect metal-induced enhancement of organic defenses were considered. For this purpose three pathosystems were established with plants growing at different Zn concentrations. The pathosystems were: Noccaea caerulescens infected with Alternaria brassicicola and Arabidopsis thaliana infected with Alternaria or Botrytis cinerea. In the case of A. thaliana, npr1, pad1, coi1 and etr1, four stress response defective mutants, were also used. Moreover, natural occurring populations of the genus Noccaea were located in the Pyrenees. Plants were identified and their Zn and Cd accumulation ability characterized with a view to future field experiments. Zn improved Noccaea resistance to Alternaria, leading to a trade-off between the metal and some of the organic-based defenses. Although SA, JA, ABA and the expression of SA, JA and JA/Et pathways marker genes were evenly induced by Alternaria 24 hours after the inoculation, one week later Zn and the hormone signaling showed a negative correlation. A trade-off was also reported between leaf glucosinolates and Zn, but, in contrast, one week after the inoculation glucosinolates concentration increased in the infected leaves with higher Zn concentration. A. thaliana WT Zn-treated plants were more resistant to Alternaria attack, but the Zn effect was not clear against Botrytis. A. thaliana WT and the stress signaling defective mutants concentrated similar leaf Zn values, that were accounted to be potentially toxic for Alternaria, but not for Botrytis. Zn amplified the expression of genes related to the SA and JA/Et signaling pathway in response to A. brassicicola infection. However, changes in the endogenous concentrations of SA, JA, ABA and ACC, were not reported to be responsible for the differences in the resistance to Alternaria. Zn-treated A. thaliana stress response defective mutants were not more resistant to none of the pathogens when Zn was applied or even more susceptible to Botrytis. As Zn did not compensate their metabolic defects, it is suggested that the plant organic defenses activated by the enhanced Zn levels against Alternaria played a more important role than Zn as a direct inorganic defense. The plants from four non-metalliferous Noccaea populations in the Eastern Pyrenees were identified attending to morphological characters as Noccaea brachypetala and they were reported to be Zn and Cd hyperaccumulators. Moreover, plants form three populations differed in the rosette shape while growing hydroponically, suggesting underlying genetic differences that were patent in the heterogeneous expression patterns of metal transporter genes in response to Zn and Cd supply. The populations were fragile and of difficult accessibility, which limits their use for field studies in metal hyperaccumulation and defense.