Electrochemical and optical nanomaterial-based biosensors for diagnostic applications

Abstract

La presente tesis describe el desarrollo de nuevos métodos de sensado basados en nuevas propiedades de nanomateriales aplicados en la detección de proteínas y ADN. El trabajo ha sido basado en dos plataformas de sensado: primero, electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs). Estos electrodos fueron aplicados en un ensayo de detección por impedancia eléctrica de nanopartículas de oro (AuNPs). Del mismo modo, SPCE fueron adaptados mediante films de polythionina y nanopartículas de Iridio (IrOxNPs) para la detección de secuencias de ADN. La segunda plataforma utilizada fue basada en papel y tiene el formato de un inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, del inglés lateral flow immunoassays). Esta plataforma se adaptó para la detección de una proteína específica Parathyroid like hormone (PTHLH) utilizando AuNPs como marcas, con el fin de obtener una nueva estrategia más simple, sin marcaje de isótopos radioactivos, menos costosa y más rápida. En el Capítulo 1 se da una visión general de las aplicaciones llevabas a cabo y mejoras aportadas por parte de nanomateriales en el campo de los biosensores, y las posibles aplicaciones en la detección de biomarcadores. En el Capítulo 2 se presentan los objetivos de la tesis. El uso de SPCE como plataforma para la detección de AuNPs mediante medidas de impedancia se presenta en el Capítulo 3 consiguiendo una mejor detección en comparación con métodos similares publicados para la detección de AuNPs. La técnica desarrollada es aplicada satisfactoriamente en la detección de AuNPs de diferente tamaño, y en un magnetoinmunoensayo utilizando AuNPs como marca para la detección de una proteína modelo. En el Capítulo 4, se presenta el trabajo relacionado con el desarrollo de nuevos sensores para la detección de DNA. El sistema está basado en la modificación de SPCEs mediante películas de un polímero y nanopartículas de óxido de iridio (IrOxNPs) sobre las cuales se inmovilizan secuencias de captura de DNA. La detección del ADN objetivo se consigue mediante medidas de impedancia eléctrica, basadas en el efecto de bloqueo del ADN hibridado para la difusión de un indicador redox a la superficie del electrodo. El biosensor resultante, que opera en modo libre de marcas, fue utilizado para la detección de secuencias de ADN específicas para el parásito de Leishmania. En el Capítulo 5 se presentan conclusiones generales y perspectivas futuras. En el Anexo A, se presenta el trabajo relacionado con las plataformas de papel para la detección de una proteína específica, PTHLH. El sistema de detección presentado es del tipo LFIA. La técnica desarrollada supone una alternativa menos costosa, más rápida y menos peligrosa a las técnicas disponibles actualmente. El límite de detección (LOD) conseguido está en el rango de ng mL-1 en muestras reales (medio de cultivo celular y lisado celulares). Además, se comprobó la compatibilidad del método desarrollado con suero humano utilizando suero humano con PTHLH añadido. En el Anexo B, se presenta el trabajo llevado a cabo en una estancia de investigación. En esta sección se presenta la fabricación de sensores electroquímicos de ADN (E-DNA) y basados en aptameros (E-Ab), y la aplicación de dicha tecnología en sensores serigrafiados de oro y en SPCE modificados con AuNPs. El Anexo C representa la investigación llevada a cabo como continuación de otra hecha anteriormente en nuestro grupo. Las condiciones y materiales encontrados previamente se aplicaron en la fabricación de una plataforma de nanocanales para la detección de una proteína secretada por células cultivadas directamente sobre la plataforma de sensado.

This thesis describes the study and development of new biosensing approaches based on novel properties of nanomaterials for the detection of proteins and DNA. The work has been performed in basis of two sensing platforms: first platform, the carbon screen-printed electrodes (SPCEs), were used in a more sensitive detection of gold nanoparticles (AuNPs) through electric impedance measurements. Furthemore, the same platform (SPCE) was adapted through polythinione films and iridium oxide nanoparticles (IrOxNPs) for the detection of specific DNA sequences in a label free assay. The second platform, paper-based platforms in format of Flow Immunoassay (LFIA), using gold nanoparticles as labels is adapted for the detection of a specific protein, Parathyroid like Hormone (PTHLH), with the aim to find a new strategy for simpler, non-hazardous, cheaper and faster detection of the protein. In Chapter 1 a general overview of the application of nanomaterials for the improvement of biosensors and its application in the field of diagnostics and biomarkers detection is presented. In Chapter 2 the objectives of the thesis are presented. Use of SPCE as platform for detection of gold nanoparticles (AuNPs) through electric impedance measurements is presented in Chapter 3. The developed technique is successfully applied in the detection of AuNPs of different sizes, and in a magnetoimmnuoassay for the detection of a model protein using AuNPs as electrochemical labels. In Chapter 4, a novel biosensor for the detection of DNA is presented. The system is based in SPCE modified with polymer films and Iridium Oxide nanoparticles, where capturing DNA sequences have been immobilized. Detection of target DNA sequences is performed through electric impedance measurements, based in the blocking effect of the DNA against the diffusion of a redox indicator to the surface of the electrode. A label free immunoassay for detection of specific sequences of Leishmania parasite’s DNA is shown. In Chapter 5 general conclusions and future perspectives of the presented work are discussed. In Annex A the work related to the paper-based platform for protein detection is presented. In this annex, detection of a specific protein (parathyroid like hormone, PTHLH) through LFIA strips is described. The developed LFIA strips represent a cheaper, faster and non-hazardous alternative to current available systems for PTHLH detection. Limits of detection (LOD) in the range of ng mL-1 for PTHLH in real samples (cell culture media, cell lysates) are reported. Furthermore, the developed system is challenged using human serum spiked with PTHLH, proving the potential of the system to detect PTHLH In human serum. In Annex B the work carried out in a research stay is presented. In this section fabrication of electrochemical DNA (E-DNA), and electrochemical aptamer (E-Ab) biosensors is described. The aim of the work was focused on adapting the E-DNA and E-Ab technology to SPCE, using AuNPs as connecting platform between the thiol modified DNA and the SPCE. Annex C represents a research done as a continuation of a previous one done in the group related mostly to the study of compatible materials with interest to be used as cells growth platforms with interest in sensing. As continuation of this work, in Annex C the conditions and materials previously selected to grow cells are applied in a nanochannel platform for the detection of a protein secreted by the cells grown directly on the sensing platform.