Development of quantum dot-based tools for in vitro and biosensing applications

Abstract

Aquesta tesi descriu l’ús de quantum dots (QDs) en el desenvolupament de noves eines per aplicacions biològiques. S’han utilitzat QDs comercials d’estructura core/shell de CdSe/ZnS amb propietats òptiques i electroquímiques úniques gràcies a les quals s’han desenvolupat diversos sensors òptics i electroquímics per detectar proteïnes, cèl·lules i ADN. Primerament es va descriure un protocol utilitzant QDs en immunocitoquímiques per visualitzar proteïnes intracel·lulars com la β-tubulina (proteïna de microtúbuls), la GM130 (proteïna de l’aparell de Golgi o la EEA1 (proteïna d’endosomes). L’ús de QDs va aportar una considerable estabilitat i robustesa a la tècnica, demostrant que podien ser usats rutinàriament com a marcadors òptics en immunocitoquímiques. Posteriorment es van utilitzar com a marcadors duals òptics/electroquímics per detectar cèl·lules apoptòtiques. Els QDs es van conjugar amb Annexina-V (AnnV), proteïna de reconeixement de la fosfatidilserina, que es transloca a la superfície externa de la membrana cel·lular en cèl·lules apoptòtiques. El marcador resultant va permetre l’adquisició d’imatges qualitatives utilitzant microscòpia confocal, l’obtenció d’imatges d’alta resolució utilitzant microscòpia electrònica de rastreig i la mesura quantitativa de cèl·lules apoptòtiques utilitzant citometria de flux. A més, la voltametria d’ona quadrada es va aplicar per desenvolupar un innovador biosensor electroquímic que permetia detectar cèl·lules apoptòtiques de manera ràpida, semiquantitativa i econòmica. Aquest treball va provar la versatilitat dels QDs, convertint-los en una eina única per fer estudis complets d’un estat biològic específic en cèl·lules vives, com ara l’apoptosi. Després, l’enfoc es va posar cap al desenvolupament d’un dispositiu per testar fàrmacs basat en l’ús de QDs i microfluídica utilitzant la mateixa estratègia de marcatge (QD-AnnV). Una sèrie de microcanals interconnectats es van dissenyar amb diferents geometries per dur a terme diverses funcions: el primer per preparar diferents concentracions de camptotecina (fàrmac pro-apoptòtic model), el segon per conjugar els QDs amb l’AnnV i, l’últim, per cultivar les cèl·lules i detectar l’efecte de la camptotecina en aquestes. L’ús de la microfluidica no només va fer els experiments més robustos, donat que tots els passos eren gairebé automatitzats, sinó que va fer el procés més econòmic, ja que la despesa de reactius era menor. L’exitosa detecció en chip de cèl·lules apoptòtiques va demostrar que la combinació d’eines innovadores, com els QDs i la microfluídica, pot donar lloc a una nova generació de plataformes de “punt de cura” (point of care) per testar fàrmacs. Finalment, els QDs es van utilitzar, conjugats amb estructures d’ADN en forma de forquilla anomenades Molecular beacons (MBs), per detectar àcids nucleics. Els MBs estaven modificats amb una molècula extintora de manera que, quan els QDs es conjugaven amb els MBs, la seva fluorescència s’apagava. Aquesta estratègia es va utilitzar per detectar seqüències d’ADN que, quan hibridaven amb els QD-MBs, feien obrir l’estructura de forquilla, fent recuperar la fluorescència dels QDs. A més, aquest procés es va integrar en un canal microfluídic transparent que permetia seguir en temps real tots els esdeveniments: la immobilització dels QDs al canal, la conjugació dels QDs amb els MBs i la hibridació amb l’analit a detectar. Per tant es pot concloure que, els QDs, a més de poder reemplaçar els fluoròfors orgànics, poden ser combinats amb mètodes electroquímics i altres tecnologies com la microfluídica, generant un ventall de biosensors i dispositius versàtils i alternatius.

This PhD thesis describes the use of quantum dots (QDs) in the development of new tools for biological applications. Commercial CdSe/ZnS core/shell QDs with unique optical and electrochemical properties have been used to develop a variety of optical and electrochemical sensors for the detection of proteins, cells and DNA. An optimized protocol to use QDs in immunocytochemistries is described to visualize intracellular proteins such as β-tubulin (microtubules protein), GM130 (golgi apparatus protein) and EEA1 (endosomes protein). The use of QDs provided a considerable stability and robustness to the technique, proving that they can be routinely used as optical labels in immunocytochemistry. In addition, QDs have been successfully used as dual optical/electrochemical labels to detect apoptotic cells. QDs were conjugated with Annexin-V (AnnV), a protein specific to phosphatidilserine, which is translocated to the outer surface of the plasma membrane in apopototic cells. The resulting label (QD-AnnV) provided excellent fluorescence images using confocal microscopy, high resolution images using scanning electron microscopy and a quantitative measurement of apoptotic cells using flow cytometry. Furthermore square wave voltammetry was applied to develop a novel electrochemical biosensor for a fast, semiquantitative and cheap detection of apoptotic cells. This work has proved the versatility of the QDs, making them a unique tool to be used for a complete study of a biological state of cells, such as apoptosis. Later on efforts were put towards the development of a device based on the use of QDs and microfluidics for drug screening using the same labeling strategy (QD-AnnV) and detecting apoptosis as well. Interconnected microchannels were designed with different geometries to perform specific tasks: the first one to prepare different concentrations of camptothecin (the pro-apoptotic drug used as model for drug screening), the second to carry out the conjugation of QDs with AnnV, and the last to culture the cells and detect the effect of the drug on them. The use of microfluidics did not only made the experiments more robust, since all the steps were mostly automated, but also more economic as less amount of reagents were required.. The successful fluorescence detection of apoptotic cells in the chip demonstrated that the combination of novel tools, such as QDs and microfluidics, allows for a new generation of point of care platforms for drug screening. Finally, QDs were also used for the detection of nucleic acids. QDs were conjugated with specific hairpin structures of DNA so called molecular beacons (MBs). MBs were modified with a quencher so, when QDs were conjugated to them, their fluorescence was turned off. This strategy was used to detect specific DNA targets which, while hybridized with the QDs-MBs hybrids, opened the hairpin structure making the fluorescence of QDs recovery from their quenching state. Furthermore, we integrate all this process in a transparent microfluidic channel, which let us monitor in real time all the steps, from the immobilization of QDs on the channel surface, followed by the conjugation with MBs and up to the hybridization of the target analyte. Thus, QDs are not only able to replace organic dyes as fluorescent labels, but they can also be combined with electrochemical methods and microfluidics, generating whole new alternatives in biosensing and drug screening.