Processing and structuring of molecular materials for environmental and biomedical applications

Abstract

Durante las últimas décadas la construcción de dispositivos basados en materiales moleculares funcionales se ha convertido en uno de los principales objetivos para la ciencia de los materiales. Aunque las propiedades fundamentales de dichos materiales (electrónicas, magnéticas, ópticas, mecánicas, etc) vienen determinadas por las propiedades de sus constituyentes moleculares, la funcionalidad final de dichos dispositivos vendrá determinada en gran medida por las diferentes técnicas de procesado y estructuración empleadas durante su construcción. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis se centra en el uso de diferentes técnicas de procesado y estructuración de compuestos con actividad medioambiental y biomédica para el desarrollo de nuevos materiales funcionales. Los metales pesados, y especialmente el mercurio, son especies altamente tóxicas cuya presencia, debida a causas tanto naturales como antropogénicas, se ha visto incrementada de forma global generando una situación de riesgo no solo para el medio ambiente sino también para el ser humano. Así pues, el desarrollo de nuevos sensores capaces de llevar a cabo la detección sensible y selectiva de iones Hg(II) disuelto en medio acuoso supone un desafío para la ciencia actual. La primera parte de esta tesis doctoral se ha basado en el procesado y nano-estructuración de dos compuestos orgánicos (1 y 2) derivados del 2,3-diaza-1,3-butadieno capaces de llevar a cabo la detección selectiva de iones Hg(II) mediante métodos ópticos. Como resultado se han obtenido diversos sistemas heterogeneos capaces de detectar la presencia dichos iones en medios acuosos. El primero de ellos, basado en un proceso de fisisorción de los indicadores previamente descritos sobre una membrana de celulosa, dio como resultado el desarrollo de sondas sensoras de un solo uso y bajo coste para la detección de Hg(II). Dichas sondas fueron preparadas siguiendo dos técnicas de estructuración diferentes. La más intuitiva de las cuales, que denominamos "técnica de revelado", se basó en el uso de un receptor orgánico sensible a la presencia de iones Hg(II) como agente revelador de una membrana de celulosa previamente impregnada con la muestra contaminada. Aunque los resultados obtenidos usando el receptor colorimétrico 1 como agente de revelado mostraban buena selectividad y reproducibilidad, la sensibilidad de dicho sistema frente a los iones Hg(II) se pudo establecer en la decenas de ppm, lejos de las unidades de ppb establecidas por la Unión Europea (EU) y la Agencia de Protección Medioambiental Estadounidense (EPA) como máximo para la presencia de iones Hg(II) en agua potable. Sin embargo este proceso sirvió como una prueba de concepto para el desarrollo de sondas sensoras basadas en el uso de materiales baratos y renovables como la celulosa para la detección de contaminantes. El otro proceso de estructuración empleado involucra la producción y deposición de nanoparticulas de los receptores orgánicos 1 y 2 sobre la superficie de membranas nanoporosas de celulosa. La obtención de estas membranas híbridas supuso un importante incremento en la sensibilidad de las sondas obtenidas alcanzando (con aquellas basadas en el uso del receptor 2) los niveles de detección exigidos por la EU y la EPA (ppb de Hg(II)). En una segunda aproximación se llevó a cabo el anclaje químico de los receptores 3 y 4 sobre la superficie de un substrato sólido para la obtención de un sensor de Hg(II) de alto rendimiento. En este caso llevamos a cabo el desarrollo de un sensor basado en la resonancia superficial de plasmón (SPR) capaz de detectar la presencia de picomoles de iones Hg(II) en medios acuosos. El diseño racional de los receptores (3 y 4) se llevó a cabo para optimizar la sensibilidad, selectividad y fiabilidad del sensor, lo cual nos permitió mejorar los parámetros establecidos por la EPA y la EU en tres ordenes de magnitud. El creciente desarrollo de la medicina regenerativa en general y la regeneración de tejidos en particular ha traído consigo una enorme mejora de la calidad de vida para decenas de miles de personas por todo el mundo. Aunque la mayoría de los biomateriales usados hoy en día presentan la estructura y resistencia adecuada para ser usados en medicina regenerativa, la interacción de dichos materiales con el entorno biológico no se controla de forma completa aun, lo cual genera, en algunos casos, efectos secundarios indeseados. El trabajo desarrollado en esta segunda parte de la tesis se centra en el estudio, caracterización y procesado de un nuevo tipo de material proteinaceo nano-particulado conocido como cuerpos de inclusión (IBs). La primera parte de esta investigación se centró en la caracterización nanoscópica de las propiedades fisico-químicas y estructurales de esta nueva familia de agregados, conocidos como IBs. Así pues, IBs provenientes de diferente trasfondo genético fueron caracterizados mediante diferentes técnicas como la dispersión dinámica de luz (DLS) la microscopia de fuerza atómica (AFM) o el ángulo de contacto (CA). Los resultados obtenidos indicaron que los IBs producidos en ausencia de diferentes elementos de la maquinaria de control de shock térmico celular (genes de la DnaK, ClpA y ClpP) exhiben una diferente distribución de tamaños, y propiedades fisico-químicas. De esta manera es posible concluir que existe una relación directa entre la conformación de las proteínas recombinantes que forman los IBs y sus propiedades. Una distribución aleatoria de IBs con diferente trasfondo genético se usó para decorar una serie de superficies químicamente modificadas con grupos amino, las cuales fueron sometidas a diferentes ensayos de proliferación celular obteniendo diferentes resultados según el origen genético de los IBs empleados. Dicho experimento probó que es posible utilizar los IBs para modificar las superficies de los materiales con objeto de obtener diferentes comportamientos de proliferación celular, expandiendo el posible uso de dichos materiales para aplicaciones en regeneración de tejidos.

During the last decades the construction of devices based on molecular functional materials with specific properties has become one of the major objectives of materials scientists, since they can offer new and exciting functionalities to the present human activities. Although their basic properties will be guided by the fundamental -electronic, magnetic, optical, mechanical, etc- properties of their molecular constituent units, the final functionality of a device will depend, in a major way, on the processing and structuring techniques used during its construction. In this context, the main objective of this Thesis has been the use of different processing and structuring techniques for the development of new functional materials based on already tested environmentally and biologically active compounds. Among all the environmentally hazardous substances present in our environment, heavy metal ions, and specially mercury, are highly toxic elements which contamination, due to both natural and anthropogenic reasons, has become severe in some parts of the world, resulting in health damage to their inhabitants. Therefore, the developing of new sensors able to detect selectively and sensitively Hg2+ on aqueous media is still an actual challenge. In this work we present two 1,4-disubstituted-2,3-diaza-1,3-butadiene derivatives (1 and 2) able to selectively perform optical detection of Hg2+ in aqueous media, that combined with different nanostructuring and anchoring techniques allowed us to obtain highly sensitive solid-supported mercury detection systems. The first of them is based on the physisorption of the diaza butadiene indicators on porous cellulose membranes obtaining indicator coated probes that could be used as new cheap and reliable Hg2+ sensing systems. In order to do that, two different structuring techniques have been used. The most intuitive one, which we have named “developing technique”, is founded on the use of the optically active Hg2+ organic receptor 1 as a Hg2+ developing agent of a cellulose substrate, previously impregnated with the contaminated solution. Although Hg2+ detection tests performed using this colorimetric chemosensing probes, based on receptor 1, showed good selectivity and reproducibility, they presented a limited sensitivity vs. Hg2+. The detection limit of the probes was set on tens of ppm (10−2g/l), far away from the 1 ppb (μg/l) fixed by the European Union (EU) and the North American Environmental Protection Agency (EPA) as the maximum amount of Hg2+ allowed in drinkable water. Nevertheless, this procedure served as a prove of concept for the developing of probes based on the use of cheap and renewable materials to be applied on the in situ detection of contaminants. The other structuring technique used is based on a new physisorption procedure, involving the production and deposition of nanoparticles of the organic sensing molecules on nanoporous cellulose membranes for the fabrication of hybrid membranes. In this case, excellent Hg2+ detection results showing a high Hg2+ sensitivity and selectivity were obtained for the receptor 2 based cellulose probes. In contrast to the previous case, the detection limit obtained matched the EU and EPA requirements for drinkable water, reaching the level of ppb (μg/l). On a second approach the covalent bonding was used as a driving force for the receptor anchoring onto a solid substrate. In this case we developed a surface plasmon resonance (SPR) sensor able to perform picomolar detection of Hg2+ on aqueous systems. The rational design of the Hg2+ receptors (3 and 4) optimizes the sensitivity and reliability of the sensor allowing us to selectively detect, in presence of other divalent cations, Hg2+ concentrations on aqueous systems on the picomolar range, meliorating on three orders of magnitude the EU and EPA Hg2+ detection limit on drinkable water. As contamination control and pollutant removal, regenerative medicine in general and particularly in tissue engineering (TE) has the enormous potential of improving the quality of life for many thousands of people throughout the world. Although most of the more commonly used biomaterials match all the structural and mechanical resistance requirements to be applied in regenerative medicine, the interaction of such materials with the surrounding biological media is still not well controlled, leading to undesired immunological responses such as infections or uncontrolled inflammation in some cases. The work developed on the second part of this thesis has been focused on the study, characterization and processing of a new kind of proteinaceous nanoparticulate biomaterial, known as inclusion bodies (IBs), as a promising additive for cell proliferation enhancement. The first part of the research regarding the processing and structuring of biologically active materials is centered on the characterization of the nanoscale, physicochemical and structural properties of a novel family of proteinaceous aggregates known as “inclusion bodies” (IBs). Thus, IBs coming from different genetic backgrounds have been characterized by means of light dispersion and surface analysis techniques, such as dynamic light scattering (DLS), atomic force microscopy (AFM) or contact angle (CA). Results obtained indicated that IBs produced in absence of different elements of the cellular heat shock machinery (DnaK, ClpA, and ClpP genes) exhibit a range of sizes, wettability and stiffness values, that let us conclude the existence of a direct relationship between the conformation status of the recombinant proteins inside the IBs and their physicochemical and structural properties. Randomly distributed IBs, from different genetic backgrounds, were used to decorate amine terminated silicon surfaces. It was possible to observe how cultured mammalian cells respond differentially to IB variants when used as particulate materials to engineer the physicochemical surface properties, proving that the actual range of referred mechanical as well as other physicochemical properties is sensed and discriminated by biological systems. To further prove the validity of IBs as stimulator of cell proliferation, microstructuring of the IBs onto the same substrate was performed using the Microcontact Printing (μCP) technique. The obtained results confirmed again the ability of IBs to stimulate cell proliferation on surfaces initially not suitable for cell growth. Therefore, it is possible to conclude that the tuning opportunities offered through adjusting the genetic background of the cell where the IBs are produced, definitively expands the spectrum of biomedical applications of this novel bacterial nanomaterial.