Mosquits del gènere Culicoides: caracterització genotípica de potencials vectors de la Llengua Blava a Catalunya i desenvolupament de noves eines diagnòstiques

Abstract

Els mosquits del gènere Culicoides actuen com a vectors de malalties importants que afecten tant a humans com a animals domèstics i salvatges. Al llarg de la última dècada aquests mosquits han tingut un paper molt important en l’epidemiologia de la major epizoòtia de Llengua Blava mai detectada a Europa, havent obligat a vacunar a milions de caps de bestiar per evitar les devastadores conseqüències que aquesta malaltia (de declaració obligatòria per la OIE) és capaç de provocar. Recentment, algunes espècies de Culicoides que pertanyen als subgèneres Avaritia i Culicoides han estat descrites com a potencials vectors de la malaltia de la Llengua Blava. En ambdós subgèneres es troben grups o complexes d’espècies que són difícils de diferenciar a nivell morfològic. Òbviament, una identificació correcta i precisa dels vectors resulta fonamental en la vigilància i control de malalties transmeses per artròpodes ja que es poden trobar diferències importants en la capacitat vectorial de les mateixes, inclús entre espècies properes. Per aquesta raó, al llarg del transcurs d’aquesta tesi doctoral s’ha procedit a identificar la presència de grups d’espècies críptiques en els subgèneres Avaritia i Culicoides, tant aquells descrits amb anterioritat com aquells no descrits, i detectar el nombre d’espècies que conformen cada un dels grups a Catalunya. S’ha identificat un total de quatre grups d’espècies críptiques, un en el subgènere Avaritia, l’anomenat grup Obsoletus, i tres en el subgènere Culicoides, els grups Pulicaris, Fagineus i Newsteadi. A continuació s’ha avaluat la validesa dels diferents caràcters morfològics diagnòstics descrits per identificar a les diferents espècies que formen part dels grups d’espècies críptiques en ambdós subgèneres i s’ha contrastat amb els resultats moleculars obtinguts a partir de la seqüenciació d’una regió d’ADN mitocondrial, concretament la subunitat I del gen Citocrom Oxidasa. En ambdós subgèneres ha estat possible detectar que alguns dels caràcters àmpliament utilitzats en la identificació de Culicoides resultaven ser erronis o bé no tenien el nivell de resolució per detectar espècies individuals en certs grups d’espècies. Per aquest motiu s’ha dissenyat i validat una bateria d’oligonucleòtids amb finalitats diagnòstiques que han permès identificar fins a 13 espècies de Culicoides que formaven part de grups d’espècies críptiques. Finalment per facilitar el diagnòstic laboratorial, s’ha dissenyat i validat diferents tipus de PCRs, one tube heminested PCR i multiplex PCR que han permès identificar, en una reacció individual, totes les espècies dins d’un mateix grup prèviament classificades com espècies críptiques.

Biting midges of the genus Culicoides act as vectors for important diseases affecting humans and both wild and domestic animals. In the last decade these midges have played an important role in the epidemiology of the major bluetongue epizootics ever recorded in Europe, forcing several EU countries to perform a mass vaccination campaign for domestic ruminants to avoid the devastating consequences that this disease (being its declaration mandatory for OIE) is able to cause. Recently, some species of Culicoides midges belonging to the subgenus Avaritia and Culicoides have been described as potential vectors for Bluetongue disease. Within both subgenera there are groups or complexes of species which are difficult to distinguish morphologically. Obviously, a correct and precise identification of arthropod vectors is essential for the surveillance and control of arthropod borne diseases, as important differences in the vectorial capacity of these species can be detected, even between closely related species. For this reason, the first part of the dissertation focussed on the detection of cryptic species within the subgenus Avaritia and Culicoides, identifying those species already described as other new species with no previous description. Finally the number of species forming each of the groups in Catalonia was studied. A total of four groups with cryptic species was detected, one in the subgenus Avaritia, named Obsoletus group, and three in the subgenus Culicoides, named Pulicaris, Fagineus and Newsteadi groups. Then, several morphological characters already described and currently in use for diagnostic purposes were assessed for their validity to identify the species present within those groups of cryptic species detected in both subgenera. The results obtained for morphological characters were compared with molecular results obtained by sequencing a region in the mitochondrial DNA, the subunit I of the gene cytochrome oxidase (COI). Within both subgenera, it was possible to detect some of the characters widely used for routine Culicoides species identification were not valid diagnostic characters in fact, as they were just not diagnostic or they did not have the necessary resolution level to detect and distinguish individual species within certain groups of species. Thus, a group of oligonucleotides with diagnostic purposes were designed and validated through a battery of single PCRs. These oligonucleotides can be used to properly detect and identify each of the thirteen species of Culicoides which were part of the detected groups of cryptic species. Finally, to facilitate the laboratorial diagnostic assay, different types of PCR were designed and validated, one tube heminested PCR and three multiplex PCRs. Each of these diagnostic PCR assays allowed to identify, in an individual PCR reaction, all the species detected within a specific group previously classified as cryptic species.