Tipificación del fenotipo inflamatorio en el asma bronquial en niños de 7 a 14 años, mediante recuento celular y determinación de citoquinas en esputo inducido

Abstract

Introducción: La inducción de esputo es una técnica escasamente invasora para el estudio y la monitorización de la inflamación de la vía aérea. Objetivos: El objetivo principal del estudio fue comparar el perfil celular y los niveles de citoquinas Th1 y Th2 en esputo inducido entre niños asmáticos atópicos, asmáticos no atópicos y sanos. Métodos: La inducción de esputo fue realizada mediante inhalación de suero salino hipertónico a concentraciones crecientes (3%, 4% y 5%). Se determinó la fracción exhalada de óxido nítrico en los pacientes asmáticos y se midió la FEV1 al inicio y después de cada período de inhalación para garantizar la seguridad de los niños. El procesado del esputo se hizo siguiendo el método de Pizzichini y cols. Se separó el esputo de la saliva y se añadió un volumen de solución de ditiotreitol igual a 4 veces el peso del esputo. Se agitó la mezcla y después de colocarla en banco mecedor durante 10 minutos se añadieron 4 volúmenes de PBS de Dulbecco. La suspensión resultante se filtró a través de una gasa de nylon de 48 micras, centrifugándose a continuación durante 10 minutos a 2.500 rpm para obtener un pellet (sedimento) celular donde se determinaron el recuento celular total y la viabilidad celular y un sobrenadante que se guardó a -80ºC para la determinación de citoquinas. Se consideró una buena muestra si la viabilidad celular era > 60% y la contaminación por células escamosas < 20%. Mediante citocentrífuga se obtuvieron las preparaciones y tras tinción de May-Grünwald-Giemsa se realizó el recuento celular diferencial con microscopio óptico. Los niveles de IFN-gamma, IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IL-4, IL-5, IL-1beta, TNF-alfa, e IL-12p70 en el sobrenadante se determinaron mediante citometría de flujo (Bender Medsystem, USA). El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS15.0. Se aplicaron los siguientes tests paramétricos o no paramétricos según los grupos seguían o no una distribución normal (prueba de normalidad de Kolmogorow-Smirnov), y según fuera apropiado: t de Student para datos no apareados, análisis de la varianza de una vía, test no paramétricos de la U de Mann-Witney, y de Kruskal-Wallis, Chi-cuadrado, prueba exacta de Fisher y correlación lineal de Pearson. Se consideraron significativos valores de p < 0,05. Los resultados se expresaron como media y desviación estándar (DE) o mediana y rango intercuartílico.

Resultados: Se realizó inducción de esputo a 77 niños asmáticos (52 varones) y a 31 sanos (17 varones) de 7 a 15 años. Entre los asmáticos, 51 no recibían tratamiento y 26 recibían corticoides inhalados. Diecisiete pacientes presentaban un asma no atópica y 60 asma atópica. Se obtuvieron 64 muestras en los asmáticos (83,1% de las inducciones) y 24 muestras en los niños sanos (77,4%) de las que 49 y 18 adecuadas respectivamente. La mediana de eosinófilos en esputo inducido de los asmáticos atópicos (1,5%) fue mayor que en los no atópicos (0%) (p=0,02) y que en los niños sanos (0%) (p=0,003). Las citoquinas Th2 (IL-4 e IL-5) y Th1 (IFNgamma, IL-2 e IL-12p70) fueron superiores en los asmáticos atópicos que en los sanos y en los asmáticos no atópicos (p<0,0001). La IL-8 fue mayor en los niños asmáticos (atópicos y no atópicos) que en los controles (p<0,0001). La IL-10 fue mayor en los controles que en los asmáticos atópicos (p=0,03). No existieron diferencias en el resto de citoquinas (IL-6, IL-1beta y TNF-alfa). Conclusiones: El perfil inflamatorio de los niños asmáticos muestra un aumento en las citoquinas proinflamatorias en el esputo inducido respecto a los niños sanos. Existen diferencias en el perfil de citoquinas en esputo inducido entre los niños asmáticos atópicos y no atópicos.

Introduction: Sputum induction is a semi-invasive technique for the study and monitorization of airway inflammation. Objectives: The aim of the present study was to compare the cellular profile and the Th1 and Th2 cytokine levels in induced sputum between atopic asthmatic, non atopic asthmatic and healthy children. Methods: Sputum induction was performed by inhalation of a hypertonic saline solution at increasing concentrations (3%, 4% and 5%). Fractional exhaled nitric oxide was determinate in asthmatic patients and FEV1 was measured at the start and after each period of inhalation to ensure children’s safety. Sputum examination was performed as described by Pizzichini et al. Sputum was separated from contaminating saliva and a weighed aliquot was dispersed with four volumes of freshly prepared dithiothreitol solution. The mixture was vortexed, and after being rocked for 10 minutes, 4 volumes of Dulbecco’s PBS was added. The suspension was then filtered through 48-µm nylon gauze and centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. This resulted in the formation of a cell pellet and supernatant solution. The supernatant was stored at -80º C for analysis of cytokines. Total cell count and cell viability was determined in the cell pellet. We considered good sample if there was cell viability ≥ 60% and contamination by squamous cells < 20%. Cytospin cell preparations were made using a cytocentrifuge and slides were stained with May-Grünwald-Giemsa to determine the differential cell count using optic microscopy. In sputum sample supernatants IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IL-4, IL-5, IL-1β, TNF-α, and IL-12p70 levels were determined by flow cytometry (Bender Medsystem, USA). Statistical analyse was performed with SPSS® 15.0 program. Parametric and non-parametric tests were applied according to normal distribution (Kolmogorov-Smirnov test): Student’s t-test for independent samples, ANOVA, Mann-Whitney U test and Kruskal-Wallis as non-parametric tests, Chi-square test and Pearson’s correlation. Values of p < 0.05 were considered significant. Results are expressed as mean and standard deviation (SD) or median and interquartile range. Results: Sputum induction was performed in 77 asthmatic children (52 boys) and in 31 healthy children (17 boys) from 7 to 15 years old. Fifty one of asthmatic children were with no treatment and 26 were receiving inhaled corticosteroids. Seventeen patients had non atopic asthma and 60 had atopic asthma. We obtained 64 samples in patients (83.1% of inductions) and 24 samples in healthy children (77.4%). We considered 49 and 18 good samples respectively. Median eosinophil count in atopic asthma (1.5%) was higher than in nonatopic asthma (0%) (p=0.02) or healthy children (0%) (p=0.003). Th2 cytokines (IL-4 and IL-5) and Th1 cytokines (IFNγ, IL-2 and IL-12p70) were higher in atopic asthmatic children than in healthy and non atopic asthmatic children (p<0,0001). IL-8 was higher in asthmatic children (atopic and non atopic) than controls (p<0,0001). IL-10 was higher in controls than atopic asthmatic children (p=0,03). There were no differences in the other cytokines (IL-6, IL-1β and TNF-α). Conclusions: The inflammatory profil of asthmatic children shows an increase in proinflammatory cytokines in induced sputum respect to healthy children. There are differences in cytokine profile of induced sputum in atopic and non atopic asthmatic children.