Producción de aldolasas recombinantes: de la biología molecular al desarrollo de procesos

Abstract

La utilización de aldolasas como biocatalizadores para la formación de enlaces C-C con estereoquímica definida depende esencialmente del descubrimiento de nuevas aldolasas y de la capacidad de disponerlas en el mercado para demostrar su poder en la síntesis de sintones quirales. <br/>El presente trabajo de tesis doctoral es una aportación al campo de las síntesis asimétricas basadas en el uso de enzimas a través de la clonación de nuevas aldolasas naturales, así como del desarrollo de procesos de obtención de aldolasas recombinantes dependientes de DHAP, de glicina y de acetaldehído para su utilización en la síntesis de compuestos complejos con dos nuevos centros quirales de estereoquímica definida y complementaria. <br/>La enzimas objetivo de este trabajo son las cuatro adolasas dependientes de DHAP (ramnulosa 1-fosfato aldolasa, fuculosa 1-fosfato aldolasa, fructosa 1,6 bifosfato aldolasa, tagatosa 1,6 bifosfato aldolasa), dos aldolasas dependientes de glicina (treonina aldolasas) y aldolasas dependientes de acetaldehído (desoxiribosa 1- fosfato aldolasa). En concreto, este trabajo se resume en cinco puntos básicos:<br/>Primero, se han clonado siete aldolasas procariotas de diversas fuentes microbianas, aunque principalmente de E. coli, en una plataforma homogénea, sencilla y versátil que permite la sobreexpresión soluble intracelular de estas enzimas como proteínas de fusión a una cola de hexahistidinas.<br/>Segundo, se ha desarrollado una estrategia general de purificación que permite obtener el producto funcional en un mínimo número de etapas con un alto rendimiento y estabilidad. <br/>Tercero, se han puesto a punto las metodologías necesarias para la determinación de las actividades aldolásicas específicas en base a ensayos enzimáticos espectrofotométricos fundamentados en la reacción con el sustrato natural de cada una. <br/>Cuarto, se ha seleccionado el sistema de producción de ramnulosa 1-fosfato aldolasa (RhuA) como modelo para definir un proceso reproducible a escala productiva, optimizando los aspectos básicos que condicionan la sobreexpresión de proteínas recombinantes en E. coli.<br/>Quinto, se ha trabajado en el desarrollo de una estrategia de cultivo semicontinuo adecuado para la obtención de cultivos de alta densidad celular, optimizando los criterios de inducción de la expresión de la proteína recombinante para maximizar la producción y productividad de RhuA.<br/>Finalmente, utilizando técnicas de biología molecular, se ha trabajado en la mejora de la plataforma de expresión para prescindir del uso de antibióticos como marcadores de selección, siempre pensando en su aplicación a escala industrial. En concreto, se ha desarrollado un plásmido de complementación de una auxotrofía para glicina que permite el crecimiento de E. coli en medios definidos sin necesidad del uso de antibióticos. Este nuevo sistema permitirá diseñar futuras estrategias de cultivo más económicas para la producción de proteínas recombinantes con un menor impacto ambiental.

Enzymes are increasingly recognized as valuable tools for organic synthesis. One of the main assets of enzymes is their ability to perform reactions in a stereoselective way, which is difficult to achieve employing protective group chemistry methods. Their high regio and stereoselectivity and catalytic efficiency make enzymes especially useful for the synthesis of complex molecules like carbohydrates, which play an important role in metabolism, as well as in cellular recognition, adhesion, molecular signalling and other relevant biological functions. In this context, aldolases constitute one of the most interesting groups of enzymes employed in biocatalysis due to their ability to catalyze the formation of C-C bonds with a defined stereochemistry leading to enantiomerically pure products, even when the starting materials are non-chiral substrates.<br/>This work represents a contribution to the field of the asymmetric synthesis based on the uses of enzymes through the clonation of new aldolasas, as well as the development and optimization of upstream and downstream processes for obtaining recombinant aldolases for its uses in the synthesis of complex compounds. <br/>The target enzymes of this work are the four DHAP dependent adolasas (rhamnulose 1-phosphate aldolasa, fuculose 1-phosphate aldolasa, fructose 1,6 biphosphate aldolase, tagatose 1,6 biphosphate aldolase), two glycine dependent aldolases (threonine aldolases) and acetaldehyde dependent aldolasas (desoxyribose 1-phosphate aldolase or DERA), all from microbial sources.<br/>In concrete, this work is summarized in five basic points: <br/>First, seven aldolases form diverse microbial sources has been cloned, mainly from E. coli, in a homogeneous, simple and versatile platform that allows its intracellular overexpression as fusion proteins to a hexahistidine tag.<br/>Second, a general strategy of purification has been developed that allows obtaining the functional product in a short number of stages with a high recovery yield and stability. <br/>Third, the methodologies for the determination of specific enzyme activities has been established based on enzymatic spectrophotometrics assays with their own natural substrates.<br/>Fourth, the production system of rhamnulose 1-phosphate aldolase (RhuA) has been selected as a model to define a productive process, optimizing basic aspects that could condition recombinant protein expression in E. coli. <br/>Fifth, Fed-batch culture techniques were employed to grow E. coli at high cell densities for the intracellular production of recombinant rhamnulose 1-phosphate aldolase (RhuA) under the transcriptional control of the strong promoter T5. A predetermined exponential feeding strategy at constant specific growth rate was selected using a defined medium, optimizing the induction conditions in order to maximize the production and productivity of RhuA. <br/>Finally, using molecular biology techniques, an alternative approach to the use of antibiotic selection marker for preventing plasmid loss based on an aminoacid auxotrophy complementation has been developed, always thinking of their application to industrial scale. This new system will allow the design of future and more economic cultivation strategies for the production of recombinant proteins with a lower environmental impact.