Diseño de nuevos materiales de afinidad universal. Aplicación en sensores

Abstract

La creciente demanda de metodologías analíticas simples, selectivas y de bajo coste para el análisis cuantitativo o semicuantitativo de analitos de variada naturaleza en muestras complejas ha favorecido el desarrollo de alternativas analíticas a los métodos clásicos de análisis. En este contexto, en la presente tesis se ha planteado como objetivo la construcción de biosensores robustos y económicos y cuya utilización no requiera supervisión profesional, para la detección descentralizada y fiable de compuestos de interés en la seguridad alimentaria y en el control medioambiental. <br/>Debido a la experiencia de nuestro grupo de trabajo y a las demostradas ventajas del material grafito-epoxi (GEC) como transductor electroquímico, se dirigieron los esfuerzos hacia la construcción de nuevos transductores basados en compósitos rígidos grafito-epoxi. Así, se abordaron dos líneas distintas de investigación: la primera, dirigida hacia la construcción de transductores biocompósitos grafito-epoxi (GEB) modificados en volumen con biomoléculas de afinidad universal, para la inmovilización de enzimas, anticuerpos, u oligonucleótidos y, la segunda, en el desarrollo de nuevos protocolos para la detección electroquímica de biomoléculas inmovilizadas en partículas magnéticas, mediante el diseño de un sensor con propiedades magnéticas, m-GEC. <br/>Abordando el primer eje de esta tesis, se estudiaron diferentes moléculas de afinidad universal para la preparación de biocompósitos, tales como la proteína A y la proteína G (para la inmovilización de anticuerpos de diferentes especificidades a través del Fc) y la estrept(avidina), para la inmovilización de prácticamente cualquier analito biotinilado, sea este enzimas, oligonucleótidos o anticuerpos. Así, se construyeron exitosamente biocompósitos de avidina (Av-GEB) capaces de inmovilizar con una excelente orientación, oligonucleótidos, enzimas y anticuerpos. Del mismo modo se diseñaron y construyeron plataformas universales para la inmovilización de anticuerpos basados en biocompósitos grafito-epoxi de proteína A (ProtA-GEB). Usando esta plataforma se consiguieron inmovilizar anticuerpos de las más variada naturaleza a través de su fracción constante para la detección de diferentes analitos como, por ejemplo, atrazina en zumo de naranja o en aguas embotelladas, alcanzando límites de detección por debajo del límite de 0.1 ?g L-1 fijado por la legislación europea. Además de estas plataformas electroquímicas de afinidad universal, se construyeron con éxito inmunocompósitos grafito-epoxi de afinidad específica (Ab-GEB), en concreto inmunocompósitos anti-atrazina para la determinación de este analito en muestras reales con una alta sensibilidad. <br/>Resultados muy prometedores se han obtenido también con el segundo eje de la presente tesis, mediante ensayos llevados a cabo con un nuevo sensor magnético basado en compósito grafito-epoxi (m-GEC) y esferas magnéticas modificadas con bioespecies. Las partículas magnéticas representan una nueva estrategia para bioanálisis que aportan numerosas ventajas adicionales. Después de un estudio exhaustivo de la inmovilización de biomoléculas sobre diferentes tipologías de esferas magnéticas funcionalizadas por diferentes grupos químicos (tosil y carboxilo) o moléculas biológicas (proteína A), se consiguió inmovilizar con éxito anticuerpos para la determinación de una familla de antibióticos (sulfonamidas) en muestras alimentarias y de anticuerpos para la determinación de atrazina en muestras alimentarias y medioambientales. Con esta estrategia se consiguió detectar atrazina en muestras tales como agua de consumo y zumo de naranja, y sulfonamidas en leche fresca o UHT entera, desnatada y semidesnatada. En este último caso, se ha conseguido rebajar en un factor de 100 los límites de detección fijados por la legislación europea. Por último, y para concluir, con el objetivo final de desarrollar en un futuro un sistema de detección de DNA de E. coli patógenas basado m-GEC y detección electroquímica, para la aplicación en seguridad alimentaria en cuanto a bacterias patógenas, se ha desarrollado un sistema de primers específicos basados en experimentos de RT-PCR.

The increasing interest in simple, selective and cost-effective analytical methodologies for quantitative analysis in different complex samples is related with the development of analytical alternatives beside instrumental methods of analysis. This thesis is focused on the development of robust, low-cost, user-friendly biosensors, for the accurate detection of compound related with food safety and environmental monitoring. <br/>One of the main expertise area in our group is the construction of conducting and rigid graphite-epoxy composites. Due to our experience as well as the improved properties of this transducer material, the research was focused on the construction of novel transducers based on rigid graphite-epoxy composite (GEC). <br/>On one hand, this thesis was focused on the construction of graphite-epoxy biocomposite (GEB) transducer bulk-modified with universal affinity biomolecules for the improved immobilization of enzymes, antibodies and oligonucleotides. On the other hand, the development of novel strategies for the electrochemical detection of biomolecules previously immobilized on magnetic beads was also performed, by the construction of a novel magneto sensor based on graphite-epoxy composite (m-GEC). <br/>In order to design graphite-epoxy biocomposite based-transducers, different universal affinity molecules such as protein A and G -for the immobilization of antibodies through the Fc region-, and strept(avidin) -for the immobilization of almost any biotinylated biomolecules such as enzymes, DNA or antibodies- were studied. <br/>Avidin graphite-epoxy biocomposite transducers -Av-GEB- with improved immobilizing properties for biotinylated DNA, antibodies and enzymes were constructed and electrochemically evaluated. In a similar way, protein A graphite-epoxy biocomposite (ProtA-GEB) transducers for the improved immobilization of antibodies with different specificities were also constructed. Atrazine in bottled water samples as well as orange juices were determined by immunosensing with this strategy, reaching the maximum residues limits established by the European Commission (0.1 ?g L-1). Beside these universal affinity platforms, graphite-epoxy immunocomposite transducers (Ab-GEB) with specific affinity were constructed for the specific detection of atrazine in real samples with high sensitivity. <br/>On the other hand, very promising results were also achieved with a novel magneto sensor based on graphite-epoxy composite (m-GEC) and magnetic beads modified with biomolecules. Magnetic beads provide further improvement to a bioassay, such as better and easier separation of the biomolecule from the complex sample. After a carefully study of the different modified magnetic beads (such as tosyl, carboxilate and Protein A modified magnetic beads), a class specific antibodies for the determination of sulfonamides as well as the specific anti-atrazine antibody were immobilized on tosyl modified magnetic beads. The detection of atrazine in water samples and orange juices, as well as sulfonamides in skimmed, semi-skimmed and full cream UHT and raw full cream milk samples was achieved following this strategy with remarkable sensitivity and reaching by far the maximum residues limits established by the European Commission. <br/>Finally, the design of a set of specific primers for the detection of pathogenic E. Coli by RT-PCR has been described. This system will be used in the electrochemical genosensing based on m-GEC of pathogenic bacteria in a near future.