Nuevas aproximaciones al estudio del metabolismo de los esteroles en tomate

Abstract

La producción de isoprenoides en tomate (Solanum lycopersicum) tiene gran importancia e interés tanto biológico como económico ya que son metabolitos especializados que participan en respuesta a factores bióticos y abióticos. Los isoprenoides son los precursores de los esteroles, quienes son componentes fundamentales de las membranas celulares y el tomate es una especie que presenta una composición atípica en el contenido y perfil de estos últimos compuestos. La síntesis de esteroles ocurre a través de la ruta metabólica del mevalonato donde la principal enzima reguladora es la HMGR, siendo la isoforma HMGR2 la enzima que se expresa durante las fases de maduración del fruto de tomate. Por otro lado la enzima esterol C22 desaturasa (SD) es la responsable de la conversión de β-sitosterol a estigmasterol. La relación β-sitosterol:estigmasterol se ha asociado con la susceptibilidad del fruto de tomate al momento de ser infectada por patógenos aunque se desconoce los efectos que esta relación tiene sobre la sensibilidad del fruto a su infección. Además de lo mencionado antes, los esteroles juegan un rol muy importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este proyecto está direccionado al estudio del metabolismo de esteroles en el fruto de tomate mediante la generación de líneas transgénicas con niveles alterados de expresión de genes que codifican enzimas involucradas en la síntesis y metabolismo de esteroles en los distintos estadíos del fruto de tomate, así como la identificación de genes candidatos que codifiquen la enzima esterilglucósido aciltranferasa (SGAT), los cuales se desconocen hasta la presente fecha. Se diseñaron plantas transgénicas que contenían niveles alterados en la expresión de los genes HMGR2 y SD, los cuales fueron regulados con las secuencias promotoras E8 y PLI. En el contexto de la caracterización de plantas transgénicas, se realizó un estudio de la cigosis de los transgenes de la generación T1 con el fin de seleccionar aquellas plantas homocigotas para el transgén de interés en el menor tiempo disponible y de manera fácil y confiable. El uso de la herramienta Real-Time qPCR demostró ser idóneo para realizar este trabajo, sin la necesidad de usar pasos agregados ni material genético adicional se lograron obtener resultado positivos. Los resultados hallados en este trabajo demostraron el correcto silenciamiento de la expresión de los genes antes mencionados en los frutos de tomate. Sin embargo, el cambio en la expresión de la isoforma HMGR2 no se mostró a nivel fenotípico, por lo que no se observaron cambios en los tiempos de maduración ni en la coloración del fruto. Estos resultados no llevaron a analizar la expresión de las demás isoformas del gen HMGR y donde se halló un cambio pronunciado en la isoforma HMGR3 en los tejidos de fruto de tomate, lo que sugirió que la activación de la expresión de HMGR3 reemplazaría la deficiencia de HMGR2 en las plantas transgénicas. En el presente también fue posible la identificación de dos genes candidatos para la función enzimática SGAT en tomate usando una fracción proteica enriquecida en actividad SGAT. Las proteínas K4D5B5 y Q71LX7, nombradas SlSGAT1 y SlSGAT2, respectivamente en este trabajo fueron analizadas in silico, donde se determinó que las características de la secuencias de aminoácidos de estas proteínas candidatas tienen funciones y sitios conservados que las hacen compatibles con la función propuesta para la enzima SGAT. Además del análisis bioinformático, se realizó la correspondiente localización subcelular de estas proteínas, donde se halló que la proteína SlSGAT1 está asociada a membrana plasmática y la SlSGAT2 al citosol.

Tomato is one of the most important vegetable crops worldwide. Because of this many efforts have been made to improve fruit qualitative parameters and its tolerance to stress. Ripening involves different biochemical processes to provide the optimal characteristics for fruit harvest, transport and consumption. Tomato has an unusual sterol composition. In addition, remarkable changes in the relative amount and composition of free and conjugated sterols occur during fruit ripening. However, the biological and evolutionary significance of the peculiar sterol composition of the tomato is currently unknown. The metabolic precursors used for sterol biosynthesis derive from the mevalonate pathway, which is mainly regulated at the step catalyzed by the enzyme HMGR. It has been proposed that the specific HMGR2 isoform is induced during fruit ripening, suggesting that it could play a relevant role in regulating fruit sterol levels. Another relevant enzyme is C22 sterol desaturase, which catalyzes the conversion ofβ-sitosterol to stigmasterol. The changes in the β-sitosterol: stigmasterol ratio reported to take place during fruit ripening have been related with its increased susceptibility to pathogen attack. Based of this, the research carried out in this thesis project has focused on the generation and characterization of transgenic tomato plants modified in the expression of HMGR2 and C22 sterol desaturase during fruit development and ripening. The obtained results have revealed the appearance of interesting phenotypes affecting fruit development as wells a complex interactions in the expression of the genes encoding HMGR in tomato. Alos of interest has been the setting up of a new method based on qPCR to identify the transgene copy number in the generated transgenic plants. Other activities have focused on the identification and characterization of two candidates genes encoding sterylglucoside aciltranferasa (SGAT) genes. Two previously uncharacterized genes potentially encoding SGAT have been identified using proteomic and genomic approaches. These genes are highly conserved among plants, suggesting that they encode enzymes catalyzing a reaction common to all plants.