Autoantigen Processing. How immunodominant thyroglobulin peptides are generated and presented by HLA-DR molecules

Abstract

Las células dendríticas (DC) son las APCs más capaces, expresan toda la maquinaria necesaria y tienen una gran capacidad de presentación eficaz. Hemos establecido que el peptidoma de APCs profesionales puede ser estudiado sin tener que recurrir a líneas celulares, usando un pequeño número de DCs derivadas de monocitos que tienden a seleccionar péptidos de muy alta afinidad que forman familias de péptidos (nested sets) como norma. Sin embargo, también presentan péptidos no convencionales. 20% de los péptidos presentados por todos los alelos eran péptidos N o C terminales. La mayoría de los C terminales se encuentran justo en el extremo de la proteína, proceden de proteínas citosólicas y no se agrupan en nested sets. También muestran residuos preferentes de corte enzimático, en comparación con los péptidos internos. Hemos utilizado moDCs y un modelo in vitro de digestión en un sistema "libre de células" (CFS) para analizar el procesamiento y la presentación de un autoantígeno tiroideo, la tiroglobulina. Tiroglobulina nativa o desnaturalizada capturada por MoDC generó muchos péptidos, con nested sets dominantes y ningún péptido derivado de los N o C terminales de la proteína. Se obtuvo un patrón similar cuando las DC se pulsaron con extractos de tejido tiroideo. Sin embargo, si la tiroglobulina se digería por las catepsinas coloidales (B, L y S) a pH 7,4 antes de pulsar las DCs, la presentación de péptidos de tiroglobulina quedó casi completamente eliminada. La gran cantidad de tiroglobulina intacta en el extracto de tejido podría ser la causa de estos datos y que la pre-digestión debe haber destruido todos los epítopos de tiroglobulina capaces de ser presentados. Sin embargo, cuando hicimos el mismo experimento utilizando el CFS, la tiroglobulina predigerida se presentó tan eficientemente como la proteína purificada. Por lo tanto, la pre-digestión no destruye los epítopos, pero en las DC los fragmentos pueden haber sido degradados antes de llegar al MIIC. Por lo tanto, el estado del antígeno es extremadamente relevante para su presentación por DCs pero el método CFS puede ayudar a identificar etapas del procesamiento que se pueden perder en el análisis de péptidos presentados por DC. Dos nested sets abundantes, de alta afinidad afinidad y dominantes de la tiroglobulina fueron identificados. Uno, asociado a HLA-DR3 con el core VVVDPSIRH y uno asociado a HLA-DR15 con el core IMQYFSHFI. El grupo VVVDPSIRH contiene el péptido Tg2098, definido como inmunodominante en un modelo in vivo de tiroiditis en ratones transgénicos HLA-DR3. El mismo péptido se identificó en el peptidoma de tiroides de pacientes de Graves' HLA-DR3+. HLA-DR15 no se asocia negativamente a tiroiditis pero en un modelo similar, ratones transgénicos HLA-DR15 no desarrollaron la enfermedad usando las mismas condiciones. Curiosamente, en DCs HLA-DR15/DR3, la mayoría de los péptidos de tiroglobulina fueron presentados por HLA-DR15 pero péptidos con este core no se encontraron en muestras de tiroides HLA-DR15+ afectados. También se encontró un segundo nested set asociado a HLA-DR3, independiente de la fuente de antígeno o el método de procesamiento. Este segundo nested set, alrededor del core VIFDANAPV, no era tan abundante como el VVVDPSIRH y contenía un péptido (Tg1574), conocido por no generar respuestas de células T en el mismo modelo que el péptido Tg2098. La diferencia funcional entre estos dos péptidos correlacionaron con dos características que son importantes en la definición de inmunodominancia, es decir, la sensibilidad a las catepsinas y a HLA-DM. Tg1574 era resistente a catepsinas mientras que Tg2098 era parcialmente sensible. Tras la digestión con varias combinaciones de catepsinas, Tg1574 no generó variantes intermedias. Sin embargo, Tg2098 fue recortado en los extremos, generando una serie de variantes, su core se mantuvo resistente a la proteolisis. Además, Tg1574 era mucho más sensible a HLA-DM que Tg2098. La interpretación de estos datos y la identificación de cuál de los dos péptidos de tiroglobulina se presenta preferentemente en el timo, serán necesarios para demostrar plenamente nuestra hipótesis.

DCs are the most capable APCs, express all the necessary machinery and have a high capacity of efficient presentation. We have established that the peptidome from unpulsed professional APC can be studied without having to resort to cell lines, using small numbers of monocyte-derived DCs that tend to select very high-affinity peptides forming nested sets as a norm. However, they also presented unconventional peptides. 20% of the peptides presented by all alleles were N-terminal or C-terminal peptides. Most C-terminal peptides were located at the very extreme of the protein, pertained to cytosolic proteins and did not cluster in nested sets. They also show preferent cleavage residues, compared to internal peptides. We have used MoDCs and an in vitro digestion model set up as a cell-free system (CFS) to analyze the processing and presentation of an AITD autoantigen, thyroglobulin. Native or denatured purified thyroglobulin captured by MoDC generated many peptides, with dominant nested sets and no peptide derived from the N- or C-terminus of the protein. Very similar pattern was obtained wen MoDC were pulsed with colloid-enriched thyroid tissue extracts. Yet, if thyroglobulin was digested by the colloid cathepsins (B, L and S) at pH 7.4 prior to pulsing, MoDCs presentation of thyroglobulin peptides was almost completely abrogated. The large amount of intact thyroglobulin in the tissue extract could be accountable for these data and that the pre-digestion must have destroyed any thyroglobulin epitope that could be presented. However, when we did the same experiment using the CFS, predigested thyroglobulin was as efficiently presented as purified protein. Therefore, pre-digestion did not destroy epitopes, the fragments may have been degraded before reaching the MIIC in MoDCs. Thus, the state of the antigen is extremely relevant for its presentation by MoDCs but, the CFS method may help identifying steps of the processing events that may be lost when analyzing DC-presented peptides. Two abundant and high affinity dominant nested sets were identified from thyroglobulin. One, associated to HLA-DR3 with the VVVDPSIRH core and one associated to HLA-DR15 with the core IMQYFSHFI. The VVVDPSIRH set contains peptide Tg2098, defined as immunodominant in an in vivo model of thyroiditis in HLA-DR3 transgenic mice. The same peptide was identified in the HLA-DR3+ peptidome from GD patients' thyroids. HLA-DR15 is not negatively associated to AITD but in a similar model, HLA-DR15 transgenic mice did not develop the disease using the same conditions. Interestingly, in HLA-DR15/DR3 MoDCs, most thyroglobulin peptides were presented by HLA-DR15 but peptides with this core were not identified in HLA-DR15+ thyroid samples affected by GD. A second nested set associated to HLA-DR3 was also found, independent of the source of antigen or the processing method. This second HLA-DR3 nested set, around the VIFDANAPV core, was not as abundant as the VVVDPSIRH and contained a peptide (Tg1574), known not to generate T cell responses in the same EAT model as the Tg2098 peptide. The functional difference between these two peptides correlated with two characteristics that are important in the definition of immunodominance, i.e. sensitivity to cathepsins and to HLA-DM. Tg1574 was cathepsin-resistant whereas Tg2098 was partially sensitive. Upon digestion with several combinations of cathepsins, Tg1574 did not generate any intermediate variants and between 45 and 100% remained intact. In contrast, Tg2098 was trimmed at the peptide ends generating a number of variants, its core was maintained resistant to cleavage and only between 6 and 26% remained intact. In addition, Tg1574 was much more sensitive to HLA-DM than Tg2098. Interpreting these data after identifying what of the two peptides is preferentially presented in thymus will be necessary to fully demonstrate our hypothesis.