Regulación de la biosíntesis de isoprenoides en Arabidopsis thaliana: Caracterización del mutante rif35

Abstract

Las plantas sintetizan una gran variedad de compuestos isoprenoides esenciales para su crecimiento y desarrollo. Sin embargo, la mayoría de los isoprenoides vegetales se incluyen en el grupo de los metabolitos secundarios y juegan un papel relevante en las interacciones de las plantas con su entorno. Algunos isoprenoides vegetales también son relevantes por su interés biotecnológico. A nivel metabólico todos los isoprenoides se sintetizan a partir de los precursores de 5 átomos de carbono isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP). Las plantas contienen dos vías metabólicas para la síntesis de dichos precursores metabólicos, la vía del mevalonato (MVA) (ubicada en el citosol) y la del metileritritol 4- fosfato (MEP) (ubicada en los plastos). En la actualidad, se conoce relativamente poco acerca de los mecanismos que participan en el control del flujo metabólico a través de la vía MEP y su interrelación con la vía del MVA.

En el trabajo desarrollado en esta tesis se han utilizado estrategias de genética reversa para estudiar nuevos aspectos relacionados con la regulación de la biosíntesis de isoprenoides en planta modelo Arabidopsis thaliana. En particular los objetivos abordado se han centrado en el análisis fenotípico, bioquímico y molecular del mutante rif35 de Arabidopsis thaliana. Dicho mutante está afectado en la funcionalidad del gen At1g73470, que codifica para una proteína de función desconocida altamente conservada en todas las plantas y cuya sobreexpresión confiere resistencia a la fosmidomicina, un inhibidor específico de la vía del MEP.

Entre los diferentes mecanismos que podrían conferir la resistencia a dicho inhibidor estaría un aumento de la actividad de la enzima diana DXR o un importe de IPP (u otro prenildifosfato) a los plastos, derivado de la vía del MVA. Es por ello que en este proyecto de tesis se ha abordado el estudio detallado de dicho mutante y la caracterización tanto del gen At1g73470 como de las proteínas correspondientes. Dentro de este contexto se han abordado los siguientes objetivos: 1) El estudio genético y fenotípico del mutante rif35 y de mutantes defectivos en el gen At1g73470, 2) La validación de las variantes de splicing descritas para el locus At1g73470 y el estudio de sus patrones de expresión en el mutante rif35 y en la variedad silvestre, 3) Estudios in silico de las proteínas correspondientes a las variantes de splicing del gen At1g73470 y análisis de su localización subcelular , y 4) La generación y caracterización de líneas transgénicas que sobreexpresan de los cDNAs correspondientes a las variantes de splicing de At1g73470.

Plants synthesize a large variety of isoprenoid compounds that are essential for growth and development. However, most plant isoprenoids are synthesized as secondary metabolites and play a key role in mediating the interactions of plants with their environment. Some plant isoprenoids are also relevant for their biotechnological interest. All isoprenoids are built from the 5-carbon precursors isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate. Plants contain two pathways for the synthesis from these precursors, the mevalonate (MVA) pathway (located in the cytosol/ER) and the recently elucidated methylerythritol 4- phosphate (MEP) pathway (located in the plastids). At present, very little is known about the regulatory mechanisms underlying the control of the metabolic flux through the MEP pathway and its cross-talk with the MVA pathway. The work in this thesis is based on the use of reverse genetics strategies to get new insights into the regulation of isoprenoid biosynthesis in the model plant Arabidopsis thaliana. The work has mainly focused rif35 mutant. This mutant is affected in the expression of the gene At1g73470, which encodes a protein of unknown function highly conserved among plants. The overexpression of this gene confers resistance to fosmidomycin, a specific inhibitor of the MEP pathway. Among the different mechanisms that may confer resistance to this inhibitor are: the increase in the activity of the target enzyme and the efficient import by the plastid of IPP derived from the MVA pathway. Based on this, the thesis project has focused on the study of the rif35 mutant and the characterization of the At1g73470 gene and the corresponding encoded proteins. This main objective has been addressed through the development of the following specific activities: genetic and phenotypic studies of the rif35 mutant and knock-out mutants defective in the At1g73470 gene; validation of the splicing variants described for the At1g73470 gene and study of their expression pattern in the rif35 mutant and wild type plants; in silico studies of the proteins encoded by the splice variants of the gene and analysis of their subcellular localization; and generation and characterization of transgenic plants overexpressing the cDNAs corresponding to splice variants of the At1g73470 gene.