Monitorización de la diversidad microbiana en biofiltros percoladores mediante pirosecuenciación tag-454 y optimización de protocolos para hibridación con fluorescencia in situ (FISH)

Abstract

La biofiltración ha demostrado ser una tecnología exitosa para la eliminación del H2S y del NH3 de las corrientes de gases contaminadas. El tema asume relevancia pues se establece como tecnología limpia y sostenible. Debido a su organización los biofiltros son considerados ecosistemas artificiales complejos en donde las variables ambientales y la composición de la comunidad están estrictamente relacionadas y de ellas depende el éxito del proceso. La diversidad de bacterias y la dinámica de la comunidad son elementos importantes del componente biológico aunque su conocimiento es aún muy limitado. Para comprenderlo mejor se necesitan perfiles poblacionales elaborados mediante herramientas de biología molecular tales como la pirosecuenciación e hibridación con fluorescencia in situ (FISH). Este fue el eje temático de la presente tesis: Estudiar la composición y la dinámica de comunidades de Eubacteria de biofiltros percoladores mediante pirosecuenciación 454-Roche (tag-454). También se procedió a optimización de protocolos FISH. Para ambas herramientas se evaluó la cobertura de la diversidad y su efectividad para el estudio y seguimiento del componente biológico.Se estudiaron dos sistemas de desulfuración de biogás, uno aerobio y otro anóxico, y un tercer sistema de tratamiento de corrientes ricas en NH3. Los resultados obtenidos demostraron que la comunidad fue capaz de sostenerse bajo las condiciones de operación probadas. En el biofiltro de desulfuración aerobia ocurrió un cambio drástico en la composición de la microbiota en función de la acidificación del medio (pH; 7-2.5), y que la pérdida de diversidad fue compensada por la eficacia de las poblaciones acidófilas. En el biofiltro anóxico los cambios poblacionales no afectaron, en general, en el rendimiento de la desulfuración del biogas, y la actividad de Sedimenticola fue determinante para el éxito del sistema. En el biofiltro percolador de NH3 se comprobó los efectos combinados de tiempos de residencia con diferentes concentraciones de entrada del gas. Las alteraciones en dichos parámetros produjeron cambios significativos en la comunidad nitrificante. Las condiciones favorecieron el crecimiento de Comamonas, Nitrosomonas (AOB) y Nitrobacter (NOB). Fue interesante encontrar una presencia marcada de bacterias desnitrificantes, cosa que no perjudicó al rendimiento de la nitrificación. En los estudios con tag-454 se encontró dificultad a la hora de asignar identidad a secuencias, lo que se justificó por la longitud insuficiente de los fragmentos y por la falta de cobertura de las bases de datos. De todos modos los resultados indicaron que la diversidad fue representada adecuadamente, permitiendo una cobertura muy buena de las distintas comunidades hecho que corrobora la efectividad de la aproximación. El trabajo de optimización de la FISH se enmarca en el conocimiento previo de la diversidad microbiológica a la hora de elegir sondas y se comprobó la influencia de la autofluorescencia del S0 sobre el recuento de células. Los resultados mostraron que la elección de los fluorocromos fue fundamental para eliminar la autofluorescencia de las partículas de S0 que originaban datos sobre-estimados de abundancia relativa.

Biofiltration has proved to be a successful technology for removal of H2S and NH3 from the contaminated gases. The subject assumes significance as it is established as a clean and sustainable technology. Due to its organization biofilters are considered complex artificial ecosystems, where environmental variables and community composition are strictly related and on them depends the success of the process. The bacterial diversity and community dynamics are very important elements of the biological component, but their knowledge is still very limited. To better understand it, populational profiles elaborated by tools such as molecular biology and genomic DNA pyrosequencing of fluorescence in situ hybridization (FISH) are required. This was the theme of this thesis: To study the composition and dynamics of Eubacteria communities in three trickling biofilters using the 454-Roche (tag-454). FISH protocols were also optimized. Two systems of biogas desulphurization were studied, one aerobic and one anoxic, plus a third system for treatment of currents rich in NH3 . The acquired results showed the ability of the community to sustain itself under the tested operational conditions. In the aerobic biofilter desulfurization it occurred a drastic change in the composition of the microbiota in terms of environmental acidification; (pH; 7-2.5), and that biodiversity loss was offset by the effectiveness of acidophilic populations. In the anoxic biofilter, changes did not affect the population in general, the performance of biogas desulfurization and Sedimenticola activity was crucial to the success of the anoxic desulfurization. In the NH3 trickling biofilter, it was proved the combined effects of residence time and different concentrations of gas entrance. Alterations in said parameters produced meaningful changes in the nitrifying community. The resulting conditions favored the growth of the Comamonas, Nitrosomonas (AOB) and Nitrobacter (NOB). It was interesting to find a strong presence of denitrifying bacteria, which did not affect the nitrification performance. In studies using tag-454, the difficulty of assigning identity to the readings of some of the found sequences, which was justified by the insufficient length of the fragments and the lack of databases coverage. Regardless, the results indicated that the diversity represented the 95% of similarity, and in the end there was a very good coverage of different communities. The relative abundance data allowed the explanation of the dynamics of said communities, fact that corroborates the approximation’s efficiency. The optimization of work by FISH relays in prior knowledge of microbial diversity when choosing probes, and proved the influence of the S0 autofluorescence over the cell count. The results showed that the choice of fluorochromes was fundamental to eliminate the autofluorescence of S0 particles that originated over-estimated data of relative abundance.