Reparació prenatal del mielomeningocele mitjançant cèl·lules mesenquimals estromals de líquid amniòtic en model oví

Abstract

Aquest treball de tesi doctoral s’emmarca en un camp de recerca dins la medicina regenerativa, l'objectiu del qual és la reparació prenatal del Mielomeningocele (MMC), que és la forma més comú i severa d’espina bífida. Aquesta malaltia congènita es caracteritza per un defecte en el tancament de la part posterior del tub neural durant el període embrionari, quedant la medul·la espinal i les seves arrels nervioses exposades al medi uterí. En conseqüència, el teixit neural pateix un deteriorament anatòmic i funcional progressiu sever, acompanyat d’una pèrdua de líquid cefaloraquidi per la zona del defecte, que dóna lloc al desenvolupament de la malformació de Chiari II i hidrocefàlia. Les tècniques utilitzades actualment en clínica han permès dur a terme cirurgies fetals amb l’objectiu de cobrir o reparar el defecte. D’aquesta manera s’aconsegueix frenar el deteriorament del teixit neural, revertir la malformació de Chiari i reduir la necessitat de derivacions ventriculo-peritoneals per tractar l’hidrocefàlia. Tot i la millora en l’estat neurocognitiu, motor i urinari, es requereixen cirurgies correctores per l’aparició de deformitats esquelètiques sobretot durant la infantesa. La manca d’estructures òssies a la part posterior de les vertebres on fixar els sistemes metàl·lics d’estabilització espinal, dificulta enormement aquestes cirurgies. En la tesi que aquí es presenta s’ha treballat en el desenvolupament d’un producte d’enginyeria tissular, basat en cèl·lules mesenquimals estromals autòlogues aïllades de líquid amniòtic (AF-oMSCs), en combinació amb diferents tipus de matrius biocompatibles en un model experimental oví de MMC induït quirúrgicament. El producte cel·lular s’ha generat a partir de mostres de líquid amniòtic, obtingudes en el moment de la cirurgia d’inducció del MMC, que s’han cultivat durant les aproximadament tres setmanes que la separen de la cirurgia de reparació. S’han caracteritzat els paràmetres cinètics, fenotípics i funcionals de les AF-oMSCs aïllades i expandides ex vivo. Així mateix, s’han posat al punt metodologies pel marcatge i seguiment cel·lular utilitzant micropartícules d’òxid de ferro (MPIOs) i la transducció amb partícules virals que codifiquen per la proteïna verda fluorescent (eGFP). S’han avaluat tres tipus de biomatrius compostes d’àcid polilàctic-co-glicòlic (PLGA), fibrina i matriu òssia desmineralitzada (DBM). Els resultats d’aquest projecte demostren la possibilitat de generar, a partir dels constructes compostos per una barreja d’AF-oMSCs, DBM i Fibrina, una estructura òssia similar a un arc vertebral posterior amb moll d’os a l’interior, ben integrat anatòmicament i rodejat per teixit connectiu, teixit adipós i recobert per pell.

The PhD project presented here aims at offering a new srategy for the repair of Myelomeningocele (MMC) using tools from Regenerative Medicine and Tissue Engineering. MMC (or spina bifida) is a congenital condition characterised by a defective closure of the neural tube during embryonic development that results in a malformation of the spinal cord, which is exposed to the uterine environment. As a consequence, the neural tissue suffers anatomic and functional degeneration along with loss of cephaloraquideum liquid from the defect site, resulting in Chiari II malformation and hydrocephalus. Approaches currently used clinically have enabled the successful performance of fetal surgery with the objective of covering and repair the defect up to some extent. This has permitted to block the progression of degenerative processes in the neural tissue, reverting Chiari malformations, and reduce the need of ventricular-peritoneal derivations for treating hydrocephalus. Despite the improvements achieved to date (particularly with respect to neurocognitive, motor and urinary status), additional corrective interventions are still required for the treatment of skeletal malformations during infancy. The lack of bony structures at the posterior side of vertebrae for fixing metallic stabilisers largely difficult such approaches. The work presented here addresses the development of tissue engineering product based on the use of Mesenchymal Stromal Cells isolated from the amniotic fluid (AF-oMSCs) combined with different types of biocompatible extracellular matrices and tested in an ovine animal model of experimental MMC induced surgically. The cellular component of the tissue engineering product investigated in this work was derived from samples of amniotic fluid harvested at the very moment of the MMC-inducing surgery, then expanded in vitro for a three-week long period, and finally administered to the animals for the treatment of MMC. A comprehensive characterisation of ex vivo expanded AF-oMSCs was performed, including phenotypic profile, multipotentiality, and the analysis of kinetic parameters of cell cultures. Furthermore labelling methods of AF-oMSCs for in vivo cell fate tracking were assessed in sheep, including Magnetic Particles of Iron Oxide (MPIO) and transduction with viruses encoding the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP). Regarding the scaffolds, polylactic-co-glycolic acid (PLGA), fibrin and demineralised bone matrix (DBM) were assayed in vitro and tested in vivo. The feasibility of generating a posterior vertebral arch-like structure in vivo after treatment of MMC with a construct composed of AF-oMSCs, DBM, and fibrin was demonstrated. Moreover, proper anatomic integration with adjacent connective and adipose tissues, recovered with skin, resembling native tissue was observed.