Estudi de la composició de la quasiespècies del virus de la hepatitis B a les regions codificants de les proteïnes de l’envolta i la polimerasa viral per seqüenciació massiva: associació de les seves variants genètiques amb el tractament antiviral de la hepatitis B crònica amb anàlegs de nucleòsids/nucleòtids

Abstract

Aquesta tesi doctoral es basa en dos estudis en els que s’analitzen les variants genètiques de la quasiespècies del virus de la hepatitis B (VHB) en una regió de la pauta oberta de lectura (ORF) de la polimerasa viral (P) on poden acumular-se mutacions relacionades amb la resistència a certs tractaments de la família dels anàlegs de nucleòsids/nucleòtids (NUCs). Aquesta anàlisi s’ha realitzat per seqüenciació massiva basada en tècniques d’“Ultra-deep pyrosequencing” (UDPS). Les mutacions seleccionades a causa del tractament antiviral a l’ORF P també poden produir canvis d’aminoàcid (aa) a l’ORF de les proteïnes de superfície (S) [tots dos ORF estan solapats a la mateixa seqüència de nucleòtids (nt)]. Alguns d’aquests canvis poden donar lloc a la pèrdua de l’acció protectora de la vacunació i/o les immunoglobulines contra el VHB (HBIg) i també a falsos negatius en els mètodes diagnòstics del VHB. En el primer estudi s’han analitzat la quasiespècies del VHB en quatre pacients amb hepatitis B crònica abans de rebre qualsevol tractament amb NUCs. Un d’aquests pacients va rebre tractament seqüencial amb diferents NUCs i es va analitzar una mostra obtinguda en finalitzar cada un d’ells. Aquestes quasiespècies virals van ser estudiades amb la primera versió de la tecnologia d’UDPS, que permetia lectures de seqüència fins a 250 nt. La metodologia desenvolupada en aquest estudi va permetre determinar la composició de variants genètiques en proporcions fins al 0,1% de la quasiespècies. Es va analitzar la variabilitat i conservació dels ORFs P i S en la quasiespècies viral abans del primer tractament amb NUCs dels quatre pacients inclosos a l’estudi [lamivudina (LAM)]. En general, la freqüència de les mutacions relacionades amb resistència a LAM no va permetre preveure la seva selecció durant aquest tractament. En el pacient analitzat longitudinalment, al llarg dels diferents tractaments es van analitzar les divergències globals de les seqüències de nt i aa i la desviació estàndard (SD) de les freqüències de les mutacions a l’ORF P. La SD va permetre identificar les més rellevants per explicar la fallada a cada un d’aquests (per tant aquests resultats tenen un valor potencialment fenotípic). L’anàlisi del lligament d’aquestes mutacions va evidenciar l’acumulació de varies d’elles en una sola variant genètica (per exemple rtL180M-rtS202G-rtM204V-rtV207I), a excepció de rtA181T/sW172stop que sol ser la única mutació en les variants que la contenen. En totes les mostres analitzades es van observar proporcions relativament elevades de variants defectives amb codons stop prematurs a l’ORF S. En el segon estudi es va analitzar la quasiespècies viral en quatre pacients amb recurrència de la infecció per VHB després del trasplantament hepàtic ortotòpic (OLT) a pesar de la profilaxi amb LAM o HBIg+LAM. En aquest estudi es va utilitzar una nova metodologia descrita prèviament pel grup del doctorand, que va permetre estudiar les variants presents en proporcions fins al 0,25% de la quasiespècies del VHB. Aquest procediment està basat en una versió de la tecnologia d’UDPS que permet obtenir seqüències fins a 400 nt, cosa que va fer possible explorar la seqüència sencera del principal epítop de l’antigen de superfície del VHB (HBsAg), el determinant “a”. Així en els quatre casos estudiats es va observar un efecte coll d’ampolla de l’OLT sobre les poblacions de variants que formen la quasiespècies del VHB, que va donar lloc a diferències rellevants entre les quasiespècies d’abans i després de l’OLT: a nivell de mutacions individuals dels ORFs P i S, que en alguns casos van donar lloc a la recurrència de la infecció sense HBsAg detectable, i a través de canvis en el genotip del VHB i en diferents índexs de diversitat de la quasiespècies viral.

This doctoral thesis is based on two studies in which the genetic variant composition of the hepatitis B virus (HBV) quasispecies was analysed in a region of the viral polymerase (P) open reading (ORF) where mutations associated with resistance to certain treatments from the nucleoside/nucleotide analogues (NUCs) family can accumulate. This analysis was performed by massive sequencing techniques based on Ultra-deep pyrosequencing (UDPS). Mutations selected in the P ORF due to antiviral treatment can also cause amino acid (aa) changes in the surface proteins (S) ORF (both ORF are overlapping in the same nucleotide [nt] sequence). Some of these changes may result in the loss of the protective action of vaccination and immunoglobulins against HBV (HBIg), and also to false negative results in HBV diagnostic methods. In the first study, the HBV quasispecies was analysed in four chronic hepatitis B patients prior to receiving any treatment with NUCs. One of these patients received sequential treatment with different NUCs and a sample obtained at the end of each of them was analysed. These viral quasispecies were studied using the first version of the UDPS technology, which made it possible to obtain sequence reads up to 250 nt. The methodology developed in this study enabled us to determine the genetic variant composition in proportions up to 0.1% of the quasispecies. In the viral quasispecies from the four patients included in this study the variability and conservation of P and S ORF was analysed before they received the first NUCs treatment (lamivudine [LAM]). Overall, the frequency of mutations associated with LAM resistance did not make it possible to predict their selection during this treatment. Throughout the different treatments of the longitudinally analysed patient, the global divergences of nt and aa sequences and the standard deviation (SD) of the frequencies of mutations in the P ORF were analysed. The SD identified the most relevant of them to explain failure in each of these treatments (therefore these results have a potential phenotypic value). The linkage analysis of these mutations showed the accumulation of several of them in a single genetic variant (e.g. rtL180M-rtS202G-rtM204V-rtV207I); except for rtA181T/sW172stop which is usually the only mutation in variants that contain it. All the samples showed relatively high proportions of defective variants with premature stop codons in the S ORF. In the second study the viral quasispecies was analysed in four patients who showed recurrence of HBV infection after orthotopic liver transplantation (OLT) despite the prophylaxis with LAM or HBIg+LAM. In this study a new methodology previously described by the candidate’s group was used, which allowed for the study of the variants present in proportions up to 0.25% of the HBV quasispecies. This procedure is based on a version of the UDPS technology which made it possible to obtain sequences of up to 400 nt in length, which allowed for the exploration of the whole sequence of the main epitope of HBV surface antigen (HBsAg), the “a” determinant. In the four cases studied a bottleneck effect was observed over the variant populations that form the HBV quasispecies due to the OLT, which resulted in significant differences between the quasispecies from before and after OLT: at the level of individual mutations in P and S ORFs, which in some cases resulted in recurrence of infection without detectable HBsAg, and through changes in the HBV genotype and in different indices of viral quasispecies diversity.