Electrochemical stripping analysis and nanoparticles for affinity biosensors

Abstract

En una primera parte de esta tesis fue desarrollado un nuevo electrodo a base de pasta de grafito-epoxi composite (GECE) conteniendo nitrato de bismuto [Bi(NO3)3] como precursor de bismuto incorporado [Bi(NO3)3-GECE)], como una posible alternativa para el análisis electroquímico por redisolución de metales pesados en cantidades traza. Los resultados claramente muestran las ventajas del Bi(NO3)3-GECE en combinación con la técnica de voltamperometría de redisolución anódica de onda cuadrada (SWASV) para la detección de metales pesados. Se llevaron a cabo medidas individuales y simultáneas de Pb y Cd y los resultados mostraron claramente las ventajas del Bi(NO3)3-GECE en combinación con la técnica SWASV para la detección de metales pesados. Con el uso del Bi(NO3)3-GECE construido se pueden realizar análisis rápidos y eficaces de iones de metal en cantidades traza como Pb y Cd entre otros en muestras ambientales de suelo, aguas naturales y aguas residuales. La ventaja inherente de la no necesidad de mercurio elimina muchas de las objeciones para el uso de métodos electroquímicos en la detección de tales especies en estos medios. <br/>Comparando el Bi(NO3)3-GECE con el electrodo de película de mercurio comúnmente usado y electrodo de película de bismuto desarrollado antes por nuestro grupo, el nuevo electrodo propuesto ofrece un notable funcionamiento en el análisis de metales pesados en cantidades traza, que puede ser de gran ventaja en electroquímica, contribuyendo a una aplicabilidad más amplia de técnicas electroquímicas por redisolución relacionadas con electrodos "sin mercurio". Además de aplicaciones ambientales el electrodo desarrollado basado en bismuto tendría interés especial para la aplicación en la detección de puntos cuánticos (QDs) basados en metales pesados. Tales aplicaciones están actualmente en proceso de estudio en nuestro grupo de investigación para la detección de ADN.<br/>Las otras partes de la tesis se dedican al desarrollo de nuevos sensores de ADN y proteínas basados en la misma técnica electroquímica de redisolución y el uso de nanopartículas de oro como marcas. <br/>Actualmente la detección electroquímica de secuencias de ADN específicas vía el evento de hibridación es una cuestión importante por lo cual diversas estrategias han sido propuestas.<br/>Genosensores electroquímicos de afinidad basados en el marcaje con nanopartículas de oro (AuNPs) y el uso de partículas paramagnéticas (MB) como plataforma para la inmovilización de la sonda de ADN de captura también han sido desarrollados en esta tesis a fin de demostrar la inducción magnética eficaz de un nuevo electrodo de grafito-epoxi composite-magnético (M-GECE) el cual fue construido también con pasta de grafito-epoxi composite con un pequeño imán de neodimio integrado.Todos los ensayos para la detección electroquímica de la hibridación del ADN desarrollados en esta tesis fueron basados en la detección directa de las marcas de AuNPs por medio de la técnica de voltametría de pulso diferencial (DPV) usando el M-GECE donde la intensidad de la corriente de la señal generada es directamente proporcional a la cantidad de ADN en la muestra. Como también ha sido demostrado, con el sensor de ADN asistido magnéticamente, el ADN analito condujo a una muy bien definida señal mientras que esencialmente ninguna señal fue observada para el ADN no complementario.<br/>Un nuevo inmunoensayo electroquímico sensible ha sido desarrollado, también basado en AuNPs como marca y MB como plataforma. El método fue evaluado para un inmunoensayo heterogéneo no competitivo de una IgG humana como proteína modelo. La detección electroquímica fue llevada a cabo en la misma forma que lo fue para ADN.<br/>La detección electroquímica de marcas de AuNPs en biosensores de afinidad usando métodos de redisolución permite el estudio detallado de la hibridación de ADN así como también inmuno-reacciones con interés en aplicaciones relacionadas con genosensores o inmunosensores. Los métodos electroquímicos usados para la detección de AuNPs como marca pueden ser muy prometedores tomando en cuenta su sensibilidad alta, límite de detección bajo, selectividad, simplicidad, bajo coste, y disponibilidad de instrumentos portátiles.<br/>Como conclusión final, las estrategias de análisis electroquímico de ADN y proteínas fueron demostradas con éxito y debido a los resultados prometedores su uso en muestras reales es viable. Tales biosensores de ADN e inmunosensores dan lugar a un enorme potencial de aplicación principalmente para diagnóstico clínico y monitoreo ambiental entre otros campos.

In the first part of this thesis a new graphite-epoxy composite electrode containing bismuth nitrate [Bi(NO3)3-GECE)], as built-in bismuth precursor as a possible alternative for electrochemical stripping analysis of trace heavy metals has been developed. Individual and simultaneous measurements of Pb and Cd were carried out and the results clearly showed the advantages of the Bi(NO3)3-GECE in combination with square wave anodic stripping voltammetry (SWASV) technique for heavy metals detection. Fast and effective analyses of trace metal ions such as Pb and Cd among others in environmental samples of soil, natural waters and effluents can be carried out by using the new Bi(NO3)3-GECE constructed. The inherent advantage of no necessity of mercury removes many of the objections for the use of the developed sensor. <br/>When comparing the Bi(NO3)3-GECE with the commonly used mercury film electrode and previously developed bismuth film electrode, the newly proposed electrode offers a remarkable performance in analysis of trace heavy metals, which can be advantageous in electrochemical, hence contributing to the wider applicability of electrochemical stripping techniques in connection with "mercury-free" electrodes. Beside environmental applications the developed bismuth based electrode would have special interest for application to heavy metal based quantum dots. Such applications are currently in the studying process at our research group for DNA detection.<br/>The other parts of the thesis are dedicated to the application of electrochemical stripping analysis in connection to gold nanoparticles for DNA and protein detection. <br/>Currently the electrochemical detection of specific DNA sequences via hybridization event is an important issue by which diverse strategies have been proposed. Affinity electrochemical genosensors based on labelling with gold nanoparticles (AuNPs) and the use of paramagnetic beads (MB) as platform for the immobilization of capture DNA probe have been also developed in this thesis in order to demonstrate the effective magnetic triggering of a new magnetic-graphite epoxy composite electrode (M-GECE) which was constructed with graphite-epoxy composite paste, with a small neodymium magnet integrated.<br/>All the assays for the DNA hybridization electrochemical detection developed in this thesis were based on the direct detection of AuNPs labels (anchored onto the M-GECE) by means of differential pulse voltammetry (DPV). The intensity of the generated current is directly proportional to the amount of DNA at the sample. As also has been demonstrated, with this magnetically assisted DNA sensor, target DNA leaded to very well defined signal whereas essentially no signal was observed for non-complementary DNA. <br/>By the other side a novel, sensitive electrochemical immunoassay has been also developed based in AuNPs as label and MB as platform. The method was studied and evaluated for a noncompetitive heterogeneous immunoassay of a human IgG as a model protein. The electrochemical detection was carried out in the same way that as for DNA.<br/>The electrochemical detection of AuNPs labels in affinity biosensors using stripping methods allows the detailed study of DNA hybridization as well as immunoreactions with interest in genosensor or immunosensor applications. The developed detection methodologies may be very promising taking into account their high sensitivity, low detection limit, selectivity, simplicity, low cost, and availability of portable instruments.<br/>As final conclusion, the DNA and protein electrochemical analysis strategies were successfully demonstrated and according to the promising results obtained its use for real samples is viable. Such DNA biosensors and immunosensors hold an enormous application potential principally for clinical diagnostic and environmental monitoring among other fields.