Aspectos microbiológicos de Burkholderia cepacia complex en pacientes con fibrosis quística

Abstract

La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad hereditaria autosómica recesiva más frecuente entre la población caucásica. La principal causa de morbilidad y mortalidad en estos pacientes es por afectación pulmonar; mayoritariamente se producen infecciones respiratorias por Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia y algunas especies del complejo Burkholderia cepacia (Bcc). Cerca del 5% de los pacientes con FQ, se encuentran colonizados o infectados por Bcc, aunque éstas también son conocidas por infectar a pacientes con enfermedad granulomatosa crónica y por ser patógenas nosocomiales. Las especies del Bcc son bacilos gramnegativos fenotípicamente similares y con una relación genética muy estrecha; por ello la identificación y diferenciación mediante técnicas de microbiología convencionales es de elevada complejidad. Actualmente se han descrito 20 especies diferentes dentro Bcc. Debido a su elevada resistencia natural a numerosos antimicrobianos, su erradicación en los pacientes con FQ es dificultosa. Además el Bcc se caracteriza por poseer múltiples factores de virulencia, así como por su capacidad de formar biofilm. Entre las especies descritas del Bcc, B. multivorans y B. cenocepacia son las más prevalentes; no obstante esta distribución no se ha mantenido igual en el tiempo, ni en todos los países. Los objetivos del presente trabajo fueron; estudiar la epidemiolgía-molecular de los aislados bacterianos pertenecientes a Bcc obtenidos de muestras respiratorias de pacientes con FQ del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona durante los años 2010 y 2012, determinar la sensibilidad a antimicrobianos y establecer la capacidad para formar biofilm de estos aislados. Por ello se identificaron mediante secuenciación del gen recA los aislados. También se comprobó la utilidad de MALDI-toF (VITEK MS y Daltonics MicroflexLT) para su identificación. La relación clonal se realizó por electroforesis en campo pulsante (PFGE) mediante la enzima SpeI. A su vez se determinaron los secuenciotipos (MLST) de los aislados y la relación clonal de éstos. Se estudió la sensibilidad a diferentes antimicrobianos utilizando la técnica disco-difusión y mediante la técnica del cristal violeta la capacidad de formar biofilm. El 5,3% de pacientes con FQ estuvo colonizado o infectado por Bcc. B. multivorans fue la especie más prevalente (43,8%), seguida de B. contaminans (37,5%), B. cepacia (18,8%) y B. stabilis (6,3%). Ambos MALDI-ToF ensayados determinaron el género del 100% de aislados, no obstante VITEK MS no determinó la especie de los aislados que pertenecían a B. stabilis y B. contaminans. Igualmente Daltonics MicroflexLT no identificó a nivel de especie los aislados de B. contaminans y un aislado de B. cepacia. En seis pacientes se aisló un mismo clon de B. contaminans (ST482), por lo que se constató la diseminación clonal de secuentiotipo. Se describieron los secuenciotipos ST17, ST450, ST723, ST724, ST725 y ST814 de B. multivorans; ST9 y ST726 de B. cepacia y ST51 de B. stabilis. De estos, ST723, ST724, ST725, ST726 y ST814 se describieron por primera vez en este estudio. El 68,2% de los aislados fueron sensibles a meropenem, 65,1% a piperacilina-tazobactam, 60,3% a ceftazidima, 54,6% a doxiciclina, 47,6% a trimetoprim-sulfametoxazol y 26,9% a ciprofloxacina. B. multivorans y B. cepacia fueron las especies más resistentes a antibióticos β-lactámicos, trimetoprim-sulfametoxazol y ciprofloxacina. B. contaminans y B. stabilis fueron los más sensibles a antibióticos β-lactámicos. Doxiciclina fue el antimicrobiano más activo frente a los aislados de B. multivorans y meropenem a los aislados de B. cepacia. Prácticamente todos los aislados tuvieron capacidad de formar biofilm. La capacidad de formar biofilm es diferente según la especie, siendo B. multivorans la que mostró mayor capacidad, aunque los aislados de un mismo clon mostraron cuantificaciones diferentes esgrimiendo la existencia de diferentes subpoblaciones de un mismo clon, con diferente capacidad de formar biofilm.

Cystic fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive hereditary disease among caucasian population. The main cause of morbidity and mortality in patients with cystic fibrosis are the current and chronic lung infections. Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia and some of the Burkholderia cepacia complex (Bcc) species are linked to the CF lung infections. About 5% of CF patients, mainly adults, are colonized or infected by Bcc, although this bacterial complex is also known to infect patients with chronic granulomatous disease and also as nosocomial pathogen. Bcc gram-negative bacilli are phenotypically very similar and genetically related, consequently the identification and differentiation using conventional microbiological techniques is difficult. Due to its high natural resistance to many antimicrobials, the eradication of Bcc in CF patients is complicated. Bcc is characterized by multiple virulence factors, including the ability to form biofilm. Among the Bcc species, B. multivorans and B. cenocepacia are the most prevalent among CF patients; however the distribution of Bcc species among the CF patients it’s changing over the years and countries. The aim of this study was to reveal the distribution of the Bcc species among the isolates obtained through respiratory samples from CF patients attended at the CF unit of Vall d’Hebron University Hospital (Barcelona) between 2010 and 2012; the susceptibility to antimicrobial agents and the ability to form biofilm were studied. 63 Bcc isolates were identified from 16 CF patients by sequencing the recA gene. Also the identification of these isolates by MALDI-TOF (VITEK MS and Daltonics Microflex LT) was determined. The clonal relatedness was performed by the PFGE employing the SpeI enzyme and the ST of all the clonal isolates by MLST. Finally the susceptibility to different antimicrobial and the biofilm quantification were analyzed by the disc-diffusion method and crystal violet technique respectively. 5,3% of CF patients were colonized or infected by Bcc. The most prevalent specie was B. multivorans (43,8%) followed by B. contaminans (37,5%), B. cepacia (18,8%) and B. stabilis (6,3%). Both MALDI-ToF analyzed in this study determined the genus of all isolates. However VITEK MS misidentified the all the B. stabilis and B. contaminans isolates. Daltonics Microflex also misidentified the B. contaminans isolates and one B. cepacia isolate. From six patients the same B. contaminans (ST482) clone was isolated, therefore the spread capacity of this clone is proven. The ST723, ST724, ST725, ST726 and ST814 have been described for the first time in this study. From all B. multivorans isolates, ST17, ST450, ST723, ST724, ST725 and ST814 were determined, from B. cepacia, ST726, ST9 and from B. stabilis, ST51 was found. By the antimicrobial susceptibility the 68,2% of the isolates were susceptible to meropenem, 65,1% to piperacillin-tazobactam, 60,3% to ceftazidime, 54,6% to doxycycline, 47,6% to trimethoprim-sulfamethoxazole and 26,9% to ciprofloxacin. B. multivorans and B. cepacia isolates were the most resistant to the betalactams, trimethoprim-sulfamethoxazole and ciprofloxacin antimicrobials. B. contaminans and B. stabilis were the most susceptible to betalactam. Doxycycline was the most effective antimicrobial agent against B. multivorans isolates and meropenem to B. cepacia isolates. Finally most of the Bcc isolates had the capacity to produce biofilm, nevertheless significant differences were determined among all the species, being B. multivorans the greatest. However the same clonal isolates showed significant differences at biofilm quantifications suggesting the presence of different subpopulations of the same clone, with different biofilm quantifications.