Robust microbial construction and efficient processes for recombinant enzymes production in Escherichia coli

Abstract

Encara que els gens de resistència a antibiòtics són una eina important per a la selecció i manteniment de plàsmids recombinants, les autoritats reguladores consideren el seu ús inacceptable en diverses àrees dins la indústria biotecnològica, sobretot quan el producte serà utilitzat amb finalitat terapèutica. Un sistema d’expressió basat en el vector pQE (Quiagen) amb un marcador de selecció plasmídic alternatiu (basat en l’auxotròfia de glicina) va ser desenvolupat prèviament (Vidal et al., 2008). El sistema d’expressió pQE es basa en el promotor T5, induïble per IPTG. La no-­‐ estabilitat del promotor en absència d’inductor pot provocar una inestabilitat estructural del vector, que portarà a nivells baixos d’expressió deguts, per exemple, a fenòmens de recombinació a la regió del promotor T5. El repressor lac, codificat pel gen lacI, s’uneix molt fortament al promotor, interferint en la transcripció del gen d’interès. Així doncs, els nivells transcripcionals del gen lacI tenen un paper crític en els sistemes d’expressió basats en el promotor T5, influenciant els nivells basals de transcripció i la concentració d’inductor. Encara que la sobreexpressió de la proteïna d’interès és un factor important en quant a càrrega metabòlica, també cal tenir en compte la contribució deguda a l’expressió d’altres gens plasmídics. En aquest sentit, per tal de millorar la robustesa del sistema i minimitzar la càrrega metabòlica relacionada amb els gens codificats als plàsmids, s’han eliminat tots els gens de resistència a antibiòtics i s’han afinat els nivells d’expressió del marcador auxotròfic (glyA) i del repressor lac (lacI). En aquest treball s’han construït uns cassettes d’expressió on els gens lacI i glyA estan sota el control d’un seguit de promotors constituents sintètics, per tal d’obtenir suficient inhibidor lacI per evitar la “no-­‐estabilitat del promotor” i assegurar el nivell mínim de transcripció de glyA necessaris tant per al manteniment del plàsmid com per al correcte creixement del cultiu en medi definit. A més, el gen de resistència a antibiòtic en el vector d’expressió va ser reemplaçat per la construcció glyA-­‐lacI, obtenint un sistema totalment lliure de gens per a la resistència a antibiòtic. Finalment, s’ha estudiat la capacitat per a la sobreexpressió de FucA recombinant a diferents escales (flascons agitats i bioreactor) i en diversos modes d’operació (discontinu i discontinu alimentat) per tal d’obtenir alts nivells d’expressió. Per últim, per tal d’analitzar la població bacteriana a nivell de cèl·∙lules individuals, els canvis morfològics (FSC i SSC) i les característiques físiques i bioquímiques de les diferents cèl·∙lules dins la població bacteriana, s’han realitzat anàlisis de citometria de flux.

While antibiotic resistance marker genes are a powerful system for selection and maintenance of recombinant plasmids in hosts such as E. coli, its use has been considered unacceptable in many areas of biotechnology by regulatory authorities, particularly when the recombinant product will be used in the therapeutic field. Previously, we have developed an expression system based on the pQE vector series (Qiagen) with an alternative plasmid selection marker based on glycine auxotrophy complementation (Vidal et al., 2008). The pQE expression system is based on the IPTG-­‐induced T5 promoter. Promoter leakiness in inducer absence may lead to structural instability of the expression vector, resulting in reduced expression levels, e.g. due to recombination events in the T5 promoter region. The lac repressor, encoded by the lacI gene, binds very tightly to the promoter, interfering with the transcription of the gene of interest. Therefore, lacI transcriptional level plays a key role in T5 promoter-­‐based expression systems, influencing the basal transcriptional levels and the concentration of inducer. Furthermore, although the overexpression of the plasmid-­‐encoded protein of interest is a major factor in the metabolic burden, expression of other plasmid-­‐genes may also contribute. Thus, in order to improve the system robustness, all the antibiotic resistance genes have been removed and the expression levels of the auxotrophic marker (glyA) and the lac repressor (lacI) genes have been fine-­‐tuned, in order to minimize the metabolic burden related to plasmid-­‐encoded genes. In this study, an expression cassette has been constructed where the lacI and glyA genes have been placed under the control of selected synthetic constitutive promoters in order to obtain the sufficient lacI inhibitor ensuring lack of “promoter leakiness” and the minimal glyA transcriptional levels needed for plasmid maintenance and optimal cell growth in defined media. Moreover, in the expression vector the antibiotic resistance gene was replaced by the lacI-­‐glyA cassette, thus yielding a completely antibiotic resistance gene free system. Finally, in order to obtain high expression levels of the protein of interest, the capacity for recombinant FucA overexpression has been investigated at different scales (shake flasks and bioreactors) and operation modes, batch and fed-­‐batch. Lastly, flow cytometry analyses were performed in order to analyze the bacterial populations at the single-­‐cell level: changes in morphology (FSC and SSC) and physical and biochemical characteristics of individual cells within a bacterial population.