Síntesis, estudio biofísico y evaluación de derivados benzimidazólicos que interaccionan con RNA con potencial antiviral

Abstract

Los IRES o Sitios Internos de Entrada Ribosomal son secuencias altamente estructuradas que se encuentran en la región no traducida del extremo 5' (5'-UTR) de diversos virus y mRNAs eucariotas que habilitan un mecanismo de traducción alternativo independiente de cap. La elevada conservación entre los genotipos virales hacen de los elementos IRES dianas potenciales hacia las que orientar el diseño de nuevos compuestos antivirales.

Hace unos años, un cribado masivo por espectrometría de masas para seleccionar ligandos del IRES de hepatitis C (HCV IRES) permitió identificar un derivado de 2-aminobenzimidazol. Estudios adicionales de relación estructura-actividad originaron Isis-11, un derivado de 2¬aminobenzimidazol que inhibía la replicación de HCV a concentraciones submicromolares. Además, Isis-11 exhibió una afinidad micromolar por el subdominio Ila del IRES de HCV, un segmento esencial para la unión correcta del IRES al ribosoma. Los estudios estructurales sobre el subdominio Ila demostraron que los ligandos basados en 2-aminobenzimidazol se unen a una protuberancia de cinco nucleótidos altamente conservada produciendo un cambio conformacional que conlleva la inhibición de la función IRES.

La fiebre aftosa (FMDV o Foot-and-Mouth Disease Virus) es un picornavirus cuya traducción es también mediada por IRES. A pesar de diferir en secuencia y estructura, los IRES de HCV y FMDV comparten ciertas similitudes. Éstas han llevado a conjeturar sobre la posibilidad que los derivados de 2-aminobenzimidazol pudieran comportarse también como ligandos del IRES de FMDV e inhibir su actividad.

En la presente Tesis, se ha descrito la preparación de nuevos derivados de Isis-11, a los que hemos nombrado IRAB (IRES Aminobenzimidazol Binder). Para ello, se ha desarrollado una nueva ruta sintética, reduciendo el número de etapas y la complejidad del procedimiento original.

Tras la síntesis se ha evaluado la interacción de los compuestos con la estructura del IRES de FMDV mediante ensayos biofísicos y de footprinting.

Los experimentos biofísicos se han llevado a cabo mediante diferentes técnicas. En un primer bloque, se intentó evaluar la interacción de los ligandos con el IRES de FMDV mediante curvas de fusión y dicroísmo circular. Tras esta evaluación preliminar, se han realizado valoraciones por fluorescencia que han permitido determinar la afinidad de los ligandos por diferentes segmentos del IRES de FMDV. A modo de comparación, se han realizado los mismos experimentos con el subdominio Ila de HCV IRES. Los resultados han mostrado afinidades en los rangos submicromolar y micromolar bajo. Por último, se llevó a cabo una caracterización termodinámica completa de la interacción mediante valoraciones por calorimetría isotérmica (ITC)

Los experimentos de footprinting mediante el radical hidroxilo y por SHAPE (Selective 2'- Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) han permitido determinar el impacto de la interacción de los ligandos sobre las estructuras secundaria y terciaria del IRES de FMDV.

En conjunto, los resultados no han mostrado un lugar único de interacción con el IRES de FMDV. No obstante, todo parece sugerir que la interacción de los ligandos con el IRES tiene lugar preferentemente con uno de los dominios del IRES esenciales para su correcta actividad, produciendo con ello un cambio conformacional sutil pero suficiente para inhibir el mecanismo de traducción mediado por IRES.

El estudio se ha completado llevando a cabo estudios de actividad de los derivados aminobenzimidazol, midiendo en primer lugar la inhibición de la traducción mediada por IRES, en FMDV y HCV, mediante experimentos in vitro, y también determinando in vivo la inhibición de replicación viral en células infectadas.

En vista de los resultados, se puede concluir que la actividad antiviral de los dos compuestos ensayados, Isis-11 e IRAB-1, tiene relación con su capacidad en interferir en la traducción de FMDV mediada por IRES por interacción directa con el RNA. Una ruta sintética más directa y la actividad sensiblemente mejor de IRAB-1 en relación a Isis-11 permiten pensar que podrán desarrollarse otros derivados IRAB con mayor actividad antiviral, producto de una mejor selectividad por el RNA IRES.

IRES or Internal Ribosomal Entry Sites are highly structured sequences harbored on the 5' untranslated region (5'-UTR) of several virus and eukaryotic mRNAs that enable an alternative cap-independent translation. Highly conserved in virus genotypes, IRESs are attractive targets to design novel antiviral drugs.

A few years ago, massive MS-screening for the selection of Hepatitis C virus IRES (HCV IRES) ligands identified a 2-aminobenzimidazole-containing compound. Further SAR studies conducted on 2-aminobenzimidazoles originated Isis-11, which inhibited HCV replication with a submicromolar EC50. Isis-11 exhibited a micromolar affinity against subdomain Ila of hepatitis C virus IRES (HCV IRES), an essential motif for the proper binding of the IRES to the ribosome. Structural studies showed that subdomain Ila contains a highly conserved 5-nucleotide bulge to which Isis-11 and related compounds can bind to promote a conformational switch that ultimately leads to IRES function inhibition.

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is a picornavirus whose translation is also driven by the IRES element present at the 5'-UTR of RNA. Although HCV and FMDV IRES differ significantly in nucleotide sequences and structure, the similarities between both IRESs led us to hypothesize that 2-aminobenzimidazole derivatives could also act as FMDV IRES binders, and lead to the inhibition of FMDV IRES-mediated translation.

We describe the preparation of new Isis-11 analogues, collectively referred to as IRAB (IRES aminobenzimidazole binders), that have been shown to inhibit FMDV IRES-dependent protein synthesis and viral replication at micromolar concentracions. A series of biophysical assays, such as circular dichroism, fluorescence and microcalorimetry, have been performed to determine the binding affinity of these ligands for segments of FMDV IRES. For comparison purposes, the same compounds have been also evaluated as HCV IRES ligands. In both cases, affinities in the micromolar and submicromolar range have been determined. SHAPE (Selective 2'-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) analysis and hydroxyl radical footprinting have been also carried out to characterize the binding of IRAB analogues to FMDV IRES.