Estudios sobre el mecanismo de plegamiento de proteinas ricas en disulfuros. Estudios sobre el inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI)

Abstract

El PCI es una proteína de 39 aminoácidos con una estructura globular central de 27 residuos y dos colas, N- terminal y C- terminal. La parte globular de la proteína presenta una hélice 310, como única estructura secundaria regular, así como 4 bucles ("loops") y está estabilizada por tres puentes disulfuro formados por las cisteínas C8- C27, C12- C24 y C18- C34. La presencia de estos puentes disulfuro nos permite estudiar el replegamiento del PCI a través de la captura de los intermediarios que se forman en el proceso de plegamiento a partir de la proteína reducida. Esto permite conocer el número de intermediarios dependientes de disulfuro, su diversidad, su estructura y sus propiedades, proporcionándonos información sobre el mecanismo de plegamiento.<br/><br/>En una primera fase del presente trabajo, hemos estudiado el aislamiento y la purificación de los intermediarios con tres puentes disulfuro (denominados "scrambled species") a partir de la mezcla de intermediarios que se obtiene tras efectuar el replegamiento del PCI a partir de PCI purificado o a partir de cultivos de E. Coli que expresan PCI. Así mismo, hemos realizado una caracterización estructural de los intermediarios "scrambled" aislados en forma pura, se han determinado sus constantes de inhibición, éstas son del orden mM (unas 1000 veces superiores a la estimada para el PCI nativo). También se ha determinado cuáles son las cisteínas implicadas en cada uno de los puentes disulfuro de la estructura de tales especies mediante digestión proteolítica y mediante reducción química parcial de un puente disulfuro. Finalmente se ha realizado un análisis conformacional por estudios de Dicroísmo Circular y Resonancia Magnética Nuclear, técnicas que nos han permitido observar que tales intermediarios no presentan una estructura mayoritaria definida.<br/><br/>En una segunda fase, hemos estudiado la última etapa del camino de plegamiento del PCI, etapa donde las especies '"scrambled"" rompen y vuelven a formar sus puentes disulfuro para dar lugar a la estructura nativa. Con este fin se ha estudiado la estabilidad relativa de estos intermediarios frente a agentes desnaturalizantes y se han llevado a cabo experimentos cinéticos de su evolución a estructura nativa. Estos experimentos han probado que el plegamiento del PCI no tiene lugar a través de una vía única sino que se dan múltiples vías paralelas. Se han observado que los intermediarios que son más estables frente a agentes desnaturalizantes son los que presentan una evolución más lenta hacia la forma nativa.<br/><br/>Finalmente en una tercera fase, se ha estudiado la influencia de agentes redox en la producción de PCI recombinante y en otras proteínas relacionadas. Se observó que la expresión de éstos en E. Coli, en forma secretada al medio, se acumulaba gran parte de la proteína en forma de intermediarios tipo "scrambled". Se ha determinado que la forma más eficiente para convertir estas especies en proteína nativa, consiste en la adición al medio tras el cultivo de agentes redox para catalizar el proceso de "reshuffling". De esta forma se consiguen importantes mejoras en el rendimiento de la producción.

Potato carboxipeptidase inhibitor (PCI) contains 39 amino acids. 27 residue composed the central globular structure and the rest composed the queue N- terminal and C- terminal. The globular part of the protein presents an helix 310, as the only secondary structure regular, and 4 loops. The protein is stabilised by tree disulfide bridges composed by the cystines: C8-C27, C12- C24 I C18- C34.<br/>The presents of this disulfide bridges let us to study the refolding of PCI by trapping the intermediates formed during the folding pathway of the reduced protein. This process let us know the number of intermediates disulfide dependents, his diversity, his structure and his proprieties, giving us information of the folding pathway.<br/><br/>In a first stage of this work, we studied how to isolate and purification the intermediates with tree disulfide bridges (denominated "scrambled spices") by the intermediates obtained from the refolding of PCI, from the PCI purification or from E.Coli cultives. With the pure "scrambled" intermediates we have done a structural characterisation and we have defined their inhibitor constants. Also we defined which are the cystines implicated in each disulfide bridge by proteolysis and by partial chemical reduction to one disulfide bridge. Finaly we have done a conformacional analysis by Circular Dicroism and Nuclear Magnetic Resonance. This techniques reveal us that the intermediates don't have a main structure defined.<br/><br/>In a second stage, we have been studied the last step of the folding pathway from PCI. During this step the scrambled spices break and refold their disulfide bridges to give the native structure. We studied the relative stability of the intermediates in front of disnatured agents and kinetics experiments of their evolution a native structure. This experiments reveal that the folding of the PCI isn't by one path, it is by multiple parallel pathways. We have seen that the most stable intermediates in front of disnature agents are the most slow to native structure.<br/><br/>Finally in a third stage, we studied the effect of redox agents in the production of recombinant PCI and other relation proteins. We have seen that most protein was accumulate in intermediates type scrambled during the E.Coli expression. We determined that the most efficient conversion to the native form is by the addition of agents redox in the medium after the grow, this agents catalite the reshuffling process. By this form we have good improve in the production rendiment.