dc.description.abstract
La proteïna quinasa CK2 és una Ser/Thr fosfotransferasa que participa en les rutes de transducció de senyal relacionades amb la proliferació cel.lular. En la forma més freqüentment descrita, és un enzim oligomèric format per subunitat catalítica alfa i subunitat reguladora beta, que s'organitzen en un tetràmer actiu del tipus alfa2beta2. L'objectiu d'aquesta tesi doctoral fou l'estudi a nivell bioquímic i funcional de la proteïna quinasa CK2 de sistemes vegetals, especialment en relació a la proliferació cel.lular.<br/>Es va purificar per cromatografia líquida la CK2 de plantes d'Arabidopsis thaliana. En aquesta espècie, com en la majoria de les plantes, es va demostrar que coexisteixen isoformes monomèriques (alfa) amb formes oligomèriques (alfa 2beta 2), ambdues actives enzimàticament i que mostren propietats bioquímiques diferents.<br/>Per a l'estudi de la regulació de la CK2 durant la divisió cel.lular es va utilitzar com a sistema biològic la línia cel.lular BY-2 de tabac, que és altament sincronitzable. L'expressió global de les subunitats alfa i beta era constitutiva al llarg del cicle cel.lular. L'activitat enzimàtica oscil.lava al llarg del cicle i mostrava pics a la transició G1/S i a Mitosi. Es proposa que les poliamines, els moduladors al.lostèrics més importants de l'activitat CK2, podrien ser en part responsables de les oscil.lacions d'activitat. La inhibició in vivo de la CK2, amb l'inhibidor específic 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole, va corroborar els pics d'activitat. El bloqueig del cicle cel.lular a les fases S i G2 provocava la mort de les cèl.lules en un interval curt de temps. El bloqueig a la fase G1 no impedia que aquestes iniciessin la replicació en el moment previst, si bé no eren capaces de completar-la perquè condensaven prematurament la cromatina. Es discuteix la possible funcionalitat de la CK2 en l'acompliment del checkpoint G2/M.<br/>L'anàlisi de l'expressió i l'activitat de la CK2 a la corba de creixement de les cèl.lules BY-2, juntament amb l'establiment del patró d'expressió de la CK2 en diferents òrgans vegetals d'A. thaliana i Raphanus sativus per hibridació in situ, va revelar que aquestes augmentaven quan s'entrava a un estadi de proliferació. A més, l'activitat CK2 es regula a través de la interacció al.lostèrica amb les poliamines, així com per la presència de la subunitat beta , controlada a nivell post-transcripcional. Per hibridació in situ, es va observar una expressió coordinada de les dues subunitats, la qual era alta en tipus cel.lulars en divisió, com els meristems, els diferents primordis vegetals i el pericicle. <br/>El cribatge d'una biblioteca de cDNA de tabac va permetre aïllar dos cDNAs per a la subunitat alfa i un per a la subunitat beta, la seqüència dels quals conservava els motius estructurals característics. Postulem que la presència d'una extensió d'uns 80 aminoàcids a l'extrem N-terminal del polipèptid beta, exclusiva de les plantes, pot ser determinant pel plegament de la forma tetramèrica activa. <br/><br/><br/><br/>Protein kinase CK2 is a widely distributed Ser/Thr phosphotransferase, that participates in signal transduction pathways involved in cell proliferation. The classical reported structure is that of a tetrameric enzyme, alfa 2beta 2, where _lfa is the catalytic subunit and beta is the regulatory subunit. The aim of this PhD was the study of the protein kinase CK2 in plant systems, specially in relation to cell proliferation process, at both biochemical and functional levels. <br/>Protein kinase CK2 from Arabidopsis thaliana seedlings was purified by liquid chromatography. In this plant, as it is described in other plant systems, two active isoforms coexist, one of them being monomeric (alfa) ant the other oligomeric (alfa 2beta 2), that show different biochemical properties.<br/>In order to investigate whether protein kinase CK2 is regulated during the cell division process in higher plants, the highly synchronizable tobacco BY-2 cell line was used. The expression of both alfa and beta subunits was constitutive throughout the cell cycle, while enzymatic activity showed oscillations, peacking at G1/S transition and Mitosis. The putative role of poliamines, the most important allosteric modulators of CK2, in the post-transcriptional regulation of CK2 activity during the cell cycle, is discussed. In vivo inhibition of CK2 by using the specific inhibitor 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole, corroborated the peaks of activity. Moreover, the blocking of the cell cycle at S and G2 phases, with the CK2 specific inhibitor, lead to the arrest of the cells in that phases and to its death shortly afterwards. In contrast, when the cells were blocked in G1, they iniciated the replication in the normal timing but they couldn't accomplish the process because the cromatin had condensed. A putative role of CK2 in the control of the G2/M checkpoint is postulated.<br/>Analysis of expression and activity of CK2 in the BY-2 growth curve, together with in situ hybridization data in different tissues in development from A. thaliana and Raphanus sativus, showed that it exists a transcriptional regulation of gene expression of both subunits when cells enter a proliferative state from a resting state. In addition, at the growth curve of the BY-2 cells, CK2 activity is regulated by controlling the _eta subunit levels by a post-transcriptional mechanism, and also by allosteric interaction with polyamines. By in situ hybridization, a coordinated expression of alfa and beta subunits in actively dividing cells, such as meristems, different organ primordia and pericicle, was observed.<br/>The screening of a tobacco cDNA library lead to the isolation of two cDNAs with homology to the alfa subunit, and one cDNA for the beta subunit. The sequences conserved the characteristic structural motifs of these proteins. The presence of an extension of aproximately 80 aminoacids at the N-terminal site of the beta subunit, which is only found in plant beta polypeptides, might be crucial for the correct folding of the active tetrameric protein.
cat
