Proteïnes petites i riques en ponts disulfur com a models de producció recombinant i plegament

Abstract

El PCI, la hirudina i el LCI formen part de la família de proteïnes petites i riques en ponts disulfur, que conté un gran nombre de biopèptids amb potencials aplicacions biotecnològiques, com són els factors de creixement, les toxines, els inhibidors de proteases o desintegrines.<br/>A causa de la presència dels ponts disulfur l'expressió recombinant d'aquestes proteïnes és complexa. En el primer treball de la tesi s'estudien tres sistemes de producció recombinant: un sistema eucariota (Pichia pastoris) i dos sistemes procariotes (Escherichia coli). S'optimitzen diversos paràmetres per tal de millorar el seu nivell de producció i es busquen sistemes que permetin simplificar el seu procés de purificació. S'aconsegueix desenvolupar un sistema en E.coli amb una producció final de proteïna que és 10 cops superior al sistema de partida.<br/>En el segon treball s'analitza el paper de les regions precursores del PCI en el plegament de la forma madura. S'analitza el procés de replegament oxidatiu in vitro de les diverses pro-formes del PCI per tal de caracteritzar la seva influència sobre la velocitat o la eficiència del plegament de la forma madura. També s'estudia la influència de la pro-regió N-terminal sobre el procés de plegament in vivo en E.coli del PCI madur i d'una sèrie de mutants que presenten un mal plegament o un baix nivell d'expressió recombinant. Finalment es duu a terme una caracterització estructural de la forma corresponent al PCI amb la pro-regió N-terminal a través d'estudis de bescanvi protó/deuteri, exoproteòlisi limitada, espectroscopia de dicroïsme circular i ressonància magnètica nuclear.<br/>En l'últim treball s'analitza el procés de plegament proteic de la hirudina i del LCI a través de l'estudi de les reaccions de bescanvi protó/deuteri seguides per espectrometria de masses MALDI-TOF. Es caracteritza l'adquisició d'estabilitat conformacional al llarg del procés de plegament de les dues proteïnes. S'aïllen una sèrie d'intermediaris de plegament i es determina la seva estabilitat; la qual cosa ens permet estudiar les diferències existents entre les vies de plegament de les dues proteïnes. Finalment s'estima la contribució de les interaccions covalents i no-covalents en l'estabilitat final de la proteïna nativa.

PCI, hirudin and LCI belong to the familly of small disulfide-rich proteins, which also contains other biologically important biopeptides like growth factors, desintegrins, toxins or protease inhibitors.<br/>These proteins cannot be usually produced at high levels by recombinant DNA approaches due to the presence of the disulfide bridges. To deal with this, we selected three different systems for heterologous expression: one based in external secretion by the yeast Pichia pastoris and two others based in the periplasmic secretion in Escherichia coli, using powerful promoters in all cases. Several parameters were optimized to improve PCI production and to simplify the purification protocol. Finally, a new method was developed, which lead to a final PCI production 10-fold higher than the previously described system. <br/>In the second work of the thesis, the role of the PCI pro-regions on the mature peptide folding was analyzed. The in vitro oxidative refolding of mature PCI was compared with that of the pro-forms to characterize their influence on mature PCI folding rates and folding efficiency, using RP-HPLC to analyze the acid-trapped disulfide intermediates collected during the refolding process. The influence of the N-terminal pro-region on the expression or folding of several PCI variants reported to give a low expression yield or a low folding efficiency in vivo in E.coli was also studied. In addition, the presence of ordered structural elements in the N-terminal extension of PCI was investigated by deuteron to proton exchange, limited exoproteolysis, circular dicroism spectroscopy and nuclear magnetic ressonance. <br/>In the last work, the folding process of hirudin and LCI was analyzed by deuteron to proton exchange monitored by MALDI-TOF mass spectrometry. The comparison of the number of slow exchanging protons of different samples along the folding pathway provided an easy and fast way to follow the protein folding process. Additionally, the deuteron to proton exchange experiments on purified folding intermediates allowed us to characterize the differences between the two folding pathways and to measure the contribution of the disulfide bonds versus the non-covalent forces to the stability of the native protein.