Studies on the molecular mechanisms of cell proliferation: phosphatidylcholine-derived lipids and lithium modulation of the MEK/ERK pathway

Abstract

Las fosfolipasas D (PLDs) son enzimas regulables que catalizan la hidrólisis de la fosfatidilcolina, un fosfofolípido mayoritario de las membranas de células eucariotas, para dar lugar a fosfatidato (PtdOH), molécula capaz de funcionar como segundo mensajero y que se ha implicado en procesos celulares como el tráfico vesicular, la reorganización del citoesqueleto y la proliferación celular. Los alcoholes primarios, como el 1-butanol, pueden derivar la formación de PtdOH por la PLD hacia la formación de los correspondientes fosfatidilalcoholes (moléculas inactivas). Es por ello que los alcoholes primarios son ampliamente usados en el estudio de las funciones celulares en las que se hayan implicados enzimas PLD. Esta tesis se centra en el estudio de procesos celulares en los que intervienen enzimas PLD, y en particular, el estudio de su implicación en el ondulamiento de la membrana plasmática (membrane ruffling) y en la proliferación celular.<br/>El ondulamiento de la membrana plasmática es un proceso dinámico que requiere del reordenamiento del citesqueleto de actina. Es fácilmente observable en células especializadas en secreción e indicativo de que la célula está exocitando activamente. Tanto mastocitos como línias celulares relacionadas responden a la estimulación por antígenos con una reorganización profunda de su citoesqueleto cortical y con la exocitosis de sus gránulos de secreción. Nosotros hemos observado que la inhibición de la formación de PtdOH por la PLD mediante la incubación con 1-butanol se traduce en la inhibición de la ondulación de la membrana plasmática en células RBL-2H3 (una línea celular mastocitaria). Dicha inhibición por 1-butanol es totalmente reversible: si se elimina el 1-butanol del medio las células recuperan la capacidad de ondular su membrana plasmática en respuesta a la estimulación por antígeno. Medidas de la actividad PLD en respuesta a antígeno indican que la ondulación de la membrana requiere de la producción continua de PtdOH por la PLD. Tanto PLD1 como PLD2 son expresadas por células RBL. En estudios de transfección con PLD1 y PLD2 marcadas con GFP (green fluorescent protein) se observa la colocalización de PLD2 en las ondulaciones de membrana de células RBL estimuladas con antígeno. Por contra, GFP-PLD1 muestra una distribución intracelular localizada en vesículas citoplasmáticas. Por ello asumimos que la isoforma PLD2 es esencial en los cambios a nivel de citoesquelto que se observan en respuesta a la estimulación por antígeno.<br/>En el estudio de la implicación de la PLD en la proliferación celular se emplearon astrocitos en cultivo como modelo celular. Se determinó la activación de la PLD en respuesta a una batería de estímulos incluyendo el promotor de tumores PMA, factores de crecimiento y agonistas de receptores metabotrópicos. Asimismo, se deteminó la estimulación de la incorporación de timidina al DNA como reflejo de la actividad mitogénica en respuesta a los mismos estímulos. Observamos una clara ausencia de correlación entre la activación de la PLD y la magitud de la respuesta mitogénica. De este dato concluimos que la formación de PtdOH por la PLD no parece ser un mecanismo comunmente implicado en la transducción de señales proliferativas. Por otra parte, la inhibición de la formación de PtdOH (por incubación en presencia de alcoholes primarios) no se traduce en la reducción de la actividad proliferativa en respuesta a diversos mitógenos, apoyando la conclusión anterior.<br/>Tras concluir que la activación de la PLD no era un requerimiento necesario en la transducción de señales mitogénicas, nos propusimos explorar mecanismos moleculares implicados en la proliferación de astrocitos. Observamos que concentraciones de litio en el rango milimolar inducen un bloqueo en el ciclo celular a nivel de G2/M en astrocitos proliferantes. Asimismo, el litio retrasa la progresión a través del ciclo celular en astrocitos deprivados de suero y estimulados por el mitógeno endotelina-1. La adición exógena de myo-inositol no es capaz de revertir los efectos del litio sobre el ciclo celular y estos no se reproducen por la inhibición selectiva de la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3). Estos resultados sugieren que los efectos del litio no son mediados ni por inhibición de inositol monofosfatasas ni por inhibición de GSK3, dos de sus dianas farmacológicas reconocidas. Por contra, el pretratamiento con litio de astrocitos proliferantes reduce la activación de ERK1/2 (extracellular regulated kinase 1/2) y de su quinasa reguladora MEK 1/2. El litio priviene también la activación de dichas quinasas en respuesta a endotelina-1 en astrocitos deprivados de suero. En células granulares de cerebelo concentraciones milimolares de litio promueven la activación de MEK y ERK. Los efectos opuestos del litio en neuronas y astrocitos nos llevan a proponer su uso terapeútico en situaciones de daño traumático en el sistema nervioso central.

Phospholipase Ds (PLDs) are regulated enzymes that catalyse the hydrolysis of phosphatydylcholine, a major lipid contituent of eukaryotic cell membranes, and generate phosphatidic acid (PtdOH), a putative second messenger molecule implicated in the regulation of vesicular trafficking, cytoskeletal reorganisation and cell proliferation. Primary alcohols such as butan-1-ol can divert the production of PtdOH generated by PLD to the correspondent phosphatydylalcohol (inactive molecule) and therefore constitute useful tools in the study of cellular functions of PLD enzymes. The present thesis aims to explore the role of PLD in different cellular events, in particular in membrane ruffling and in cell proliferation.<br/>Membrane ruffling is a dynamic phenomenon taking place at the plasma membrane that requires the rearrangement of the actin cytoskeleton. It is very prominent in cells specialised in secretion and is indicative of ongoing exocytosis. Mast cells and related cell lines, when stimulated with antigen, show a dramatic alteration of their cytoskeleton required for the release of secretory granules by exocytosis. We have observed that inhibition of PLD-derived PtdOH fomation by butan-1-ol results in the halt of antigen-stimulated membrane ruffling in a mast cell line (RBL-2H3 cells). Inhibition by butan-1-ol was completely reversible because its removal restored membrane ruffling. Measurements of PLD activation by antigen indicate a requirement for continual PtdOH formation during ruffling. PLD1 and PLD2 are both expressed in RBL cells and green fluorescent-tagged (GFP) proteins were used to identify PLD2 localizing to membrane ruffles in antigen-stimulated RBL cells. In contrast, GFP-PLD1 localised in intracellular vesicles and remained in this location after stimulation with antigen. We therefore assume that PLD2 is essential for actin cytoskeletal rearrangements triggered by antigen. <br/>The role of PLD in cell proliferation was studied in cultured astrocytes. We monitored PLD activation elicited by a set of different stimuli including the tumour promoter PMA, growth factors and G protein-coupled receptor agonists. As an index of the mitogenic response, thymidine incorporation into DNA in response to these stimuli was also monitored. We observed a lack of correlation between PLD activation and the extent of the mitogenic response, suggesting that PtdOH formation was not a common mechanism involved in mitogenic signal transduction. In agreement with this conclusion, primary alcohol inhibition of PtdOH formation by PLD does not result in the inhibition of the mitogen-stimulated incorporation of thymidine into DNA. <br/>Having observed that PLD may not be part of the mitogenic signal transduction machinery, we further explored molecular mechanims involved in astrocyte proliferation. We observed that millimolar lithium concentrations induced a G2/M cell cycle arrest in proliferating astrocytes and also delays cell cycle reentry by the mitogen endothelin-1. Myo-inositol supplementation of the culture medium could not overcome lithium-induced cell cycle arrest and selective inhibition of glycogen synthase kinase-3 (GSK3) by compound SB216763 could not reproduce lithium effects on cell cycle distribution. This results indicate that lithium effects are unlikely mediated by inhibition of inositol monophosphate phosphatases nor GSK3 inhibition, two pharmacological targets mediating lithium actions in other settings. Interestingly, lithium pretreatment of proliferating astrocytes results in reduced phosphorylaton of extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and the upstream kinase MEK1/2. Lithium also prevents endothelin-1-stimulated phosphorylation of ERK1/2 and MEK1/2 in serum-deprived astrocytes. In cerebellar granule cells millimolar lithium enhanced ERK and MEK phosphorylation. We propose that he opposing effects of lithium in neurons and astrocytes make lithium treatment a promising strategy to favour neuronal repair and reduce reactive gliosis after traumatic injury.