Paper de l'apoptosi en el dany cel·lular per isquèmia cerebral: mecanismes moleculars implicats i neuroprotecció

Abstract

La isquèmia cerebral es caracteritza per una interrupció del flux sanguini, la qual cosa comporta una mort neuronal de la zona afectada. Els mecanismes cel.lulars i moleculars de la mort neuronal induïda per isquèmia es desconeixen però s'ha proposat que la depleció d'energia i la pèrdua dels gradient iònics provocarien un alliberament de glutamat, que és el neurotransmissor excitatori majoritari en sistema nerviós central de mamífers, per la reversió de la funció dels seus recaptadors de membrana. L'acumulació de glutamat comporta una sobreexcitació dels seus receptors sinàptics i desencadena una mort neuronal fulminant. Tradicionalment, aquesta mort cel.lular s'ha descrit com una mort per necrosi, però en els darrers anys, s'ha descrit l'existència d'un altre component de mort, més retardat, anomenat apoptosi. En el present treball s'ha establert un model d'isquèmia in vitro per deprivació d'oxigen i glucosa (OGD), en cultius primaris de neurones corticals de rata. El model ha permès estudiar els mecanismes que s'activen en una isquèmia cerebral i que porten a una mort neural la qual ve mediada, principalment, pel glutamat via receptor NMDA. S'ha pogut caracteritzar i quantificar la necrosi i l'apoptosi induïda per l'exposició a l'OGD. A més, l'aparició de l'apoptosi correlaciona amb l'activació de la caspasa 3, un dels marcadors més rellevants de la mort cel.lular programada, i també de les caspases 7 i 9. L'exposició a l'OGD també indueix l'alliberament de TNFa, la síntesi de ceramida de novo i la translocació a nucli del factor de transcripció NFkB, els quals medien part de l'activació de la caspasa 3 i per tant part de l'apoptosi isquèmica. D'altra banda, el model ofereix la possibilitat de controlar la finestra temporal d'intervenció farmacològica, i permet determinar l'efectivitat de les substàncies abans, durant i després de l'OGD. En estudiar el sistema histaminèrgic en l'exposició a l'OGD es va concloure que els antagonistes dels receptors H2 de la histamina, i principalment la ranitidina, disminuïen la mort cel.lular induïda per OGD majoritàriament reduint l'activació de la caspasa 3. El seu efecte neuroprotector podia observar-se fins i tot administrant l'antagonista H2 tres i sis hores després de l'exposició a l'OGD i sense pretractament .Tots aquests resultats van servir per validar el model d'isquèmia in vitro per a l'estudi dels mecanismes cel.lulars i moleculars implicats en la isquèmia cerebral.

Cerebral ischemia is characterized by an interruption of cerebral blood flow that triggers neuronal cell death. Cellular and molecular mechanisms of ischemic neuronal cell death are unknown but it has been proposed that ischemia-induced energy depletion and impairment of ionic gradients provoked a massive release of glutamate from synaptic terminals. Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in mammalian CNS and during cerebral ischemia is released by reversed function of its neuronal and glial uptake system. Glutamate accumulation in the extracellular space produces a sobreexcitation of its synaptic receptors that triggers a fulminant neuronal death by necrosis. Traditionally ischemia-induced cell death has been described as necrotic but in the last decade, evidence of programmed cell death or apoptosis has emmerged. In the present thesis, a in vitro model model of cerebral ischemia has been stablished exposing mixed cortical neuronal-glial cell cultures to glucose and oxygen deprivation. The model allowed to study the activation of different mechanisms during in vitro cerebral ischemia that elicited NMDA-mediated cell death. Necrosis and apoptosis were characterized and quantifyed after OGD exposure. Apoptosis appearence correlated well with caspase 3 activation, one of the most rellevant apoptotic markers. Caspase 7 and caspase 9 were also activated after exposure to OGD. A in vitro cerebral ischemia triggered TNFa release, de novo ceramide production and NFkB nuclear translocation. All these factors seemed to mediate ischemia-induced caspasa 3 activation and neuronal apoptosis.<br/>On the other hand the model offered the possibility to control the therapeutic window of pharmacological intervention and allowed to study the effectiveness of different drugs before, during and after OGD exposure. After examining the relationship beetwen histaminergic system and ischemia-induced cell death, we concluded that Histamine receptor 2 antagonists and mainly Ranitidine, reduced neuronal cell death after an OGD exposure. They reduced apoptosis appearence by reducing ischemia-induced caspase 3 activation. Their neuroprotective effect was seen even if the cultures were treated three or six hours following OGD exposure . All these results validated the in vitro model of OGD to study cellular and molecular mechanisms implicated in cerebral ischemia.