Plegamiento y funcionalidad biológica del inhibidor de metalocarboxipeptidasas LCI

Abstract

En el primer trabajo de esta tesis se dilucida el camino de plegamiento oxidativo del LCI. El LCI reducido y desnaturalizado se repliega a través de un flujo secuencial y rápido de intermediarios de uno y dos puentes disulfuro, y llega a una etapa limitante en la cual la mezcla de tres especies mayoritarias que contienen 3 puentes disulfuro y una población heterogénea de isómeros de cuatro puentes disulfuro no nativos (scrambled) coexisten. Los intermediarios de tres puentes disulfuro se han identificado como trampas cinéticas que se hallan a lo largo del camino de plegamiento del LCI, y se han caracterizado sus estructuras: dos de ellos contienen sólo puentes disulfuro nativos. El camino de plegamiento del LCI comprende propiedades exhibidas tanto por el BPTI como por la hirudina, dos modelos divergentes con características de plegamiento opuestas. Los resultados obtenidos en el estudio de las vías de plegamiento del LCI confirman el enorme espectro de diversidad de los caminos de plegamiento de las proteínas.<br/>En el segundo trabajo de esta tesis se dilucidan las curvas de desplegamiento y desnaturalización del LCI. En presencia de un agente iniciador de la formación de tioles y un agente desnaturalizante se despliega el LCI nativo por el intercambio de sus puentes disulfuro, y la molécula se transforma en una mezcla de especies scrambled. Podemos distinguir claramente y aislar, entre los 104 posibles isómeros scrambled del LCI, a nueve de ellos que representan el 90% del total del LCI desplegado. La concentración de tiocianato de guanidinio e hidrocloruro de guanidinio requeridas para alcanzar el 50% de la desnaturalización son de 2,4 y 3,6 M, respectivamente. El LCI nativo es resistente a la desnaturalización por urea, incluso a concentraciones elevadas (8M). El camino de desplegamiento del LCI se ha podido definir en base a la evolución de la concentración relativa de los isómeros scrambled de la molécula a lo largo de su desnaturalización.<br/>Existen dos poblaciones de especies scrambled que sufren variaciones a lo largo del camino de desplegamiento. Una población se acumula como intermediarios bajo condiciones desnaturalizantes fuertes (incluye al isómero denominado beads-form). La otra población muestra una correlación inversa entre su abundancia relativa y las condiciones desnaturalizantes y debería poseer otro tipo de estructuras no nativas. Los resultados que se presentan en el segundo trabajo muestran que el LCI, una molécula con potenciales aplicaciones biotecnológicas, tiene cinéticas bajas de desplegamiento y es altamente estable.<br/>En el tercer trabajo de esta tesis se estudia el efecto del LCI en la fibrinólisis in vitro. Se ha descrito, tanto por estudios in vitro como in vivo, que el PCI (potato carboxypeptidase inhibitor) incrementa la tasa de lisis de los coágulos de fibrina. Con este mismo propósito, hemos evaluado y comparado la capacidad profibrinolítica del LCI con la del PCI. Todos los resultados han sido obtenidos en ensayos con plasma humano, en un sistema in vitro.<br/>Hemos demostrado que ambos inhibidores, el LCI y el PCI, aceleran de forma substancial la lisis de los coágulos tratados con t-PA, esta aceleración es dependiente de la concentración de inhibidor. El LCI se ha mostrado unas 10 veces más potente que el PCI como acelerador de la fibrinólisis, y también muestra una mayor capacidad inhibidora de TAFI al realizar ensayos de actividad enzimática en plasma.<br/>Se ha estudiado el posible efecto de estos dos inhibidores sobre la estructura del coágulo de fibrina mediante microscopía electrónica de transmisión y de barrido. Se ha observado un incremento significativo en el grosor de las fibras y una disminución simultánea en la densidad de su entrecruzamiento: el LCI puede tener una aplicación en las terapias trombolíticas basadas en t-PA.

The pathway of oxidative folding of LCI has been elucidated in the present work, using structural and kinetic analysis of the folding intermediates trapped by acid quenching. Reduced and denatured LCI refolds through a rapid, sequential flow of 1- and 2-disulfide intermediates and reaches a rate limiting step in which a mixture of three major 3-disulfide species and a heterogeneous population of non-native 4-disulfide (scrambled) isomers co-exist. The three 3-disulfide intermediates have been identified as major kinetic traps along the folding pathway of LCI, and their disulfide structures have been elucidated in this work. Two of them contain only native disulfide pairings, and one contains one native and two non-native disulfide bonds. The folding pathway of LCI features properties exhibited by both bovine pancreatic trypsin inhibitor and hirudin, two diverse models with extreme folding characteristics. The results further demonstrate the large diversity of disulfide folding pathways. <br/>The unfolding and denaturation curves of leech carboxypeptidase inhibitor (LCI) were elucidated using the technique of disulfide scrambling. In the presence of thiol initiator and denaturant, the native LCI denatures by shuffling its native disulfide bonds and transforms into a mixture of scrambled species. Nine out of 104 possible scrambled isomers of LCI, amounting to 90% of total denatured LCI, can be distinguished. The denaturation curve, shows that the concentration of guanidine thiocyanate and guanidine hydrochloride required to reach 50% of denaturation is 2.4M and 3.6M, respectively. Native LCI is resistant to urea denaturation, even at high concentration (8M). The LCI unfolding pathway was defined based on the evolution of the relative concentration of scrambled isoforms of LCI upon denaturation. Two populations of scrambled species suffer variations along the unfolding pathway. One accumulates as intermediates under strong denaturating conditions, and corresponds to open or relaxed structures, one of which turned out to be the bead-form isomer. The other population shows an inverse correlation between their relative abundances and the denaturing conditions, and should have another kind of non-native structure, more compact than the unfolded state. The rate constants of unfolding of LCI are low when compared to other disulfide containing proteins. The results presented in this study show unequivocally the high stability and low kinetics of unfolding of the LCI fold, that guarantee the appropriate industrial and therapeutical handling of the molecule.<br/>The potato carboxypeptidase inhibitor (PCI) has recently been reported to enhance the rate of fibrin clot lysis induced by tissue plasminogen activator (t-PA). Here, we have studied the fibrinolytic activity of LCI (leech carboxypeptidase inhibitor), and compared its effectiveness with that of PCI in vitro. Both LCI and PCI markedly accelerate the t-PA-induced lysis of human plasma clots in a concentration-dependent manner. Besides being approximately 10-fold more potent in accelerating fibrinolysis, LCI also showed a greater TAFIa inhibitory activity than PCI in enzymatic assays. The effects of both TAFIa inhibitors on the fibrin clot structure were compared by scanning and transmission electron microscopy. A significant increase in fiber thickness and a simultaneous decrease in the density of fiber entanglement were observed when clotting of human plasma was induced in the presence of either LCI or PCI. These alterations of clot structure correlated with the increased lysis rate determined in turbidimetric assays. In inhibitor-treated samples, formation of large pores within the fibrin gel occurs earlier than in controls, supporting the role of LCI as enhancer of clot lysis. These results suggest that LCI may be useful to improve the t-PA based therapy of thrombosis.