Influència estructural i funcional de mutacions extrecel·lulars de la bacteriorodopsina: efectes locals i a llarga distància

Abstract

La bacteriorodopsina (bR) és una proteïna transmembranal de set hèlices a de l'arqueobactèria Halobacterium salinarum. La bR té unida covalentment via una Base de Schiff (BS) protonada una molècula de retinal, cromòfor responsable de que, activada per la llum, la bacteriorodopsina bombegi protons des de l'interior al exterior de la cèl·lula. Aquest bombeig es realitza mitjançant un fotocicle, successió d'estats conformacionals i bioquímics anomenats intermediaris pels que passa la proteïna per dur a terme la translocació de protons. El gradient electroquímic de protons generat es aprofitat per les ATP sintases per a sintetitzar ATP, energia que és utilitzada per la bactèria en cas d'emergència quan hi ha una baixa disponibilitat d'oxigen en l'ambient. Gràcies al interès que despertà el descobriment d'un sistema fotosintètic tan senzill, la bR és una de les proteïnes transmembranals més conegudes i s'usa com a model per a l'estudi d'altres proteïnes de membrana com són els receptors acoblats a proteïna G. <br/>El treball presentat en aquesta tesi es troba centrat en la regió extracel·lular de la proteïna i s'ha agrupat en tres blocs diferents. En el primer, s'ha estudiat el rol funcional i estructural de diversos grups formadors de ponts d'hidrogen mitjançant les mutacions R7E/E9R, Y79F i S193A. L'estudi d'aquests mutants mostra que la tirosina 79, l'arginina 7 i el glutàmic 9 són grups importants per el manteniment estructural de la bR, ja que aquestes mutacions produeixen una acceleració en el temps de reacció de la hidroxilamina, indicant una menor compactació de les hèlices en aquests mutants. Aquestes alteracions de la bR produeixen alhora una disminució en l'estabilitat tèrmica de la proteïna. No obstant, aquestes mutacions no afecten de manera rellevant la funció de la bR, excepte pel fet de disminuir en una unitat de pH el pKa del complex alliberador del protó. La Tyr 79, el Glu 9 i l'Arg 7 es troben actuant com a nexe d'unió entre una xarxa d'aigües principal que connecta el retinal amb la zona extracel·lular de la proteïna, i una xarxa d'aigües local. Per una altra banda, la substitució de la serina 193 per una alanina dóna lloc a canvis estructurals de la proteïna i a un augment en el pKa del complex alliberador del protó, apart d'una important disminució en l'eficiència bombejadora de protons, demostrant que aquesta serina, mitjançant les seves interaccions amb el glutàmic 204, s'encarrega de mantenir la correcta funcionalitat i estructura del complex.<br/>En el segon bloc s'ha estudiat el paper funcional y estructural de les prolines 8, 77 i 200 que, disposades en forma de butxaca, es troben albergant quatre molècules d'aigua que formarien una xarxa d'aigües local. Encara que les prolines actuarien podrien interaccionar mitjançant un pont d'hidrogen amb aquestes molècules d'aigua, sembla ser que la distància entre els diferents grups seria massa important com per que dita interacció succeís. No obstant, la rigidesa de la cadena polipeptídica generada per les prolines, donaria lloc a que grups veïns a aquestes prolines poguessin interaccionar amb la xarxa d'aigües. La substitució d'aquestes prolines per glicines de forma individual i triple, i la substitució de la prolina 8 per un triptòfan, donen lloc a una sèrie d'alteracions importants en l'entorn del retinal, com és un increment en el pKa del principal contraió de la BS, l'Asp 85, o la disminució del pKa de la BS. Aquestes alteracions van acompanyades d'una menor compactació de les hèlices en realitzar les mutacions tal i com indiquen els experiments d'accessibilitat per la hidroxilamina. En el cas del mutant P200G el que s'ha observat ha estat una més gran compactació de la proteïna comparant amb la bR silvestre, indicant que al substituir la prolina per una glicina s'està donant una més gran rigidesa en les hèlices durant el fotocicle. Les mutacions P8W, P77G i P200G, a més a més presenten una important disminució en la capacitat bombejadora de protons. Tots aquests efectes es produirien per una alteració en les interaccions entre els grups veïns a les prolines i les molècules d'aigua de la xarxa local i altres grups de la proteïna. En el tercer i darrer bloc presentat, s'han aportat dades vers la relació a llarga distància entre l'aspàrtic 96 i el glutàmic 194. L'Asp 96 es troba localitzat en la regió citoplasmàtica de la bR, i és el grup encarregat de reprotonar la BS un cop aquesta s'ha desprotonat. Quan aquest aspàrtic és substituït per una asparragina, el protó que ha de reprotonar la BS prové directament del citoplasma, fet que fa més lenta la seva reprotonació. El Glu 194 per altra banda es troba localitzat en la regió extracel·lular i forma part del complex alliberador del protó. Quan s'afegeix la mutació E194Q al mutant D96N s'observa una important acceleració en la reprotonació de la BS tal i om ho indiquen els experiments de fotòlisi de llampec i espectroscòpia d'infraroig. Aquests resultats indicarien que l'anul·lació de la càrrega negativa del glutàmic 194 situat a la regió extracel·lular, estaria afectant l'entrada de protons des del costat citoplasmàtic indicant doncs, una interacció a llarga distància. El doble mutant a més presenta una important alteració del mecanisme de bombeig de protons, no solament perquè l'expulsió i recaptació del protó es realitza simultàniament en la proteïna, sinó perquè també l'eficiència del bombeig en aquest mutant és d'un 35 % comparat amb la bR silvestre.<br/>En aquest treball a més s'ha demostrat que com que l'aparició de l'intermediari M depèn de l'estat de protonació del Glu 194, el pKa d'aparició d'aquest intermediari és en realitat el pKa del complex alliberador del protó en l'estat basal de la proteïna. Per altre costat, els resultats de pKa alcalí obtingut per als diferents mutants estudiats en aquesta tesi, mostren que la desprotonació de la BS no és suficient per produir la desnaturalització de la proteïna degut a pH alcalí, sinó que a més seria necessària la desprotonació d'altres grups a pH bàsics com podrien ser diverses tirosines.

The Bacteriorhodopsin (bR) is a seven a-helices transmembrane protein from the arqueobacterium Halobacterium salinarum. The bR has a molecule of retinal covalently bound through a protonated Schiff Base (BS); this chromophore, after light activation, is the responsible of the pumping of protons from inside to outside of the cell by bR. This pumping activity is performed through the photocycle, a series of conformational and biochemical states of the protein called intermediates, which results in the proton pumping. Thus, an electrochemical gradient is generated, and these protons are used by ATPsynthases to synthesise ATP, energy used by the bacterium in case of emergency when very low oxygen availability exists in the ambient. Thanks to the interest of the discovery of a so simple photosynthetic system, the bR is one of the best known transmembrane proteins and it is used as a model of study for other transmembrane proteins like G-protein coupled receptors. <br/>The work presented in this thesis has been focused in the extracellular region of the protein and it has been divided in three different blocks. First of all we have studied the functional and structural role of several hydrogen-bonding residues through the construction of the mutants R7E/E9R, Y79F and S193A. The study of these mutants has demonstrated that tyrosine 79, arginine 7 and glutamic 9 are important groups for the structural maintenance of the bR, observing an altered time of reaction of the hydroxylamine, thus, indicating a reduced compactness of the helices in these mutants. These alterations of the bR produce, in addition, a diminished thermal stability of the protein. However, these mutations do not affect eminently the function of the bR, except by the decrease of one unit pH of the pKa of the proton release group. Tyr 79, Glu 9 and Arg 7 act as a binding nexus between the principal water network that connects the SB with the extracellular region, and a local water network. On the other hand, the substitution of the serine 193 by alanine produces structural changes of the protein and an increase in the pKa of the proton release group, in addition to an important decrease in the proton pumping efficiency, demonstrating that this serine, through its interactions with the glutamic 204, maintains the correct functionality and structure of the group. <br/>In the second block we have studied the functional and structural role of the prolines 8, 77 and 200 that seems to act as a pocket where several water molecules are located forming a local water network. Although the prolines can interact by hydrogen-bonding with these water molecules, it seems that the distance among the different groups is too high to allow the formation of this interaction. However, the rigidity produced by the polypeptidic chain of these, could allow the interaction of surrounding groups with this waters molecules. The individual and multiple substitution of these prolines by glicines, and the substitution of the proline 8 by a tryptophan produce several important alterations in the contour of the retinal, such as the increased pKa of the principal contra-ion of the SB, the Asp 85, and the diminished pKa of the SB. Moreover these mutants present lower helices compactness as is shown by hydroxylamine experiments. However, in the case of the mutant P200G we observe increased helices compactness compared to the wild type bR, indicating that the substitution of this proline is producing a more important rigidity of the helices during the photocycle. Besides, the mutations P8W, P77G and P200G present an important diminished proton pumping efficiency. All these effects would be produced by the alteration of the interactions among the surrounding groups of the prolines and the water molecules of the local network and other groups of the protein.<br/>In the last block presented in this thesis, we have provided more data about the long-range interactions between the aspartic 96 and the glutamic 194. The Asp 96 is located in the cytoplasm region of the bR and is the group that reprotonates the SB during the N intermediate. When this aspartic is mutated by an asparagine, the proton that reprotonates the SB comes directly from the cytoplasm, this fact produces a delay in its reprotonation. On the other side, he Glu 194, is located in the extracellular region and it is involved in the proton release group. When the mutation E194Q is added to the mutant D96N we observe an important speed up of the reprotonation of the SB as is shown by flash photolysis and infrared spectroscopy experiments. These results would indicate that the abolition of the negative charge of the Glu 194, located in the extracellular region, would be affecting the entrance of protons in the cytoplasmatic region, indicating a long-range interaction. Moreover, the double mutant shows an important alteration in the proton pumping mechanism as is seen not only by a release and capture of the proton done simultaneously in this mutant, but also by a decrease of the proton pumping efficiency of about a 35 % compared to the bR wild type. <br/>Besides, in this thesis we have demonstrated that as the formation of the M intermediate depends on the protonated state of the Glu 194, the pKa of the formation of this intermediate is truly the pKa of the proton release group in the ground state of the protein. On the other hand, the experiments of basic pH for the different mutants have shown that the deprotonation of the SB is not sufficient to produce the denaturation of the protein. It seems that the deprotonation of other groups at high pH, like tyrosines, is necessary to produce this denaturation.