Caracterització de l'activitat i el fenotip de la proteasa del VIH-1 mitjançant un sistema de cribratge genètic basat en el bacteriòfag lambda

Abstract

Els inhibidors de la transcriptasa inversa vírica i de la proteasa, són dos tipus de fàrmacs àmpliament utilitzats en la lluita contra el virus de la immunodeficiència humana tipus-1 (VIH-1). Un correcte ús i disseny dels tractaments, pot conduir a una inhibició sostinguda de la replicació vírica, tot i que, no a una eliminació de la infecció. Un dels majors obstacles de la teràpia, és l'aparició de mutacions en el genoma víric, associades a una disminució de l'eficàcia terapèutica. Les pròpies característiques del VIH afavoreixen l'aparició d'aquestes mutacions que faciliten la imposició de variants capaces d'escapar a les situacions adverses, com pot ser la presència d'un fàrmac antiretroviral. En aquest treball s'han analitzat l'efecte que una major o menor inhibició de la replicació vírica pot tenir sobre l'evolució vírica i l'aparició de mutants de resistència. Dels resultats dels treballs realitzats vam poder concloure que, el nivell de supressió de la replicació vírica, condiciona la facilitat d'aparició de mutacions associades a resistència, malgrat l'existència d'evolució genètica. També es va analitzar l'ús d'un sistema de cribratge genètic basat en el bacteriòfag lambda. Aquest sistema va ser dissenyat per l'anàlisi de proteases específiques pel lloc de tall, com és la proteasa del VIH-1. Tant l'acitivitat com la susceptibilitat als inhibidors de la proteasa són dos paràmetres importants a determinar de les diverses variants genètiques d'aquest enzim. Així vam veure que aquest sistema era útil per l'anàlisi de proteases obtingudes de mostres de pacients i permetia preveure la resposta a un posterior canvi de tractament. Altrament era molt sensible a la detecció de variacions en l'activitat proteolítica induida per canvis simples en la cadena aminoacídica, així com també permetia detectar canvis en la sensibilitat als diversos inhibidors de la proteasa. En resum doncs, vam concloure que, el sistema de cribratge basat en el bacteriòfag lambda constituiex una bona eina per a la caracterització de proteases del VIH-1 rellevants clínicament, així com, per la profundització en l'estudi i caracterització d'aquesta proteïna i les seves variants.

Inhibitors of protease and reverse transcriptase, are both widely used as drugs for threatment of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection. A correct use and design of threatments can reach an inhibition of viral replication during long periods of time. One of the major problems of therapy is the appearance of mutations in the viral genome associated with a diminution of therapy efficacy. The easy incorporation of mutations during replication of HIV-1, allowed the appearance of scape mutants. Here we evaluated how the level of viral replication can afect the appearance of genotipic resistance. We concluded that the level of supresion of viral replication conditionate the appearance of resistance associated mutations despite the existence of genetic evolution. We also evaluated the use of a bacteriophage lambda-based genetic screening system. This system was designed to evaluate cleavage site specific proteases as HIV-1 protease. The activity and drug susceptibility are two parameters important of HIV-1 protease variants. We found the system useful for the analysis of HIV-1 proteases from patient samples and was useful too, to predict the efect of a new therapy. The system was also very sensible to detect changes of the proteolytic activity due to simple genetic mutaions. In summary, we concluded that the lambda-based genetic screening system was a good tool to characterisate HIV-1 proteases clinically important, as was for the further study and characterisation of this protein and its variants.