Structural and Functional Studies on Proteinaceous Metallocarboxypeptidase Inhibitors

Abstract

La present tesi està formada per sis treballs de recerca independents que estan situats en el camp dels inhibidors de metal·locarboxipeptidases: s'estudia el seu plegament, estabilitat, estructura i funció. <br/>El primer treball inclou l'aïllament i el clonatge de l'ADNc d'un nou inhibidor de carboxipeptidases de la paparra, anomenat TCI. Els estudis realitzats sobre la forma recombinant del TCI indiquen que aquesta proteïna està fortament limitada pels seus ponts disulfur, sent molt estable enfront un ampli rang de pH i altament resistent a condicions desnaturalitzants. El TCI recombinant és un inhibidor que s'uneix fortament a TAFIa, estimulant així la fibrinòlisi in vitro, fet que li confereix potencial en aplicacions de prevenció o tractament de desordres trombòtics.<br/>El segon treball presenta l'estructura cristal·lina del TCI unit a la carboxipeptidasa A bovina i a la carboxipeptidasa B humana. El TCI està format per dos dominis que són estructuralment molt semblants a pesar de tenir un baix grau d'homologia seqüencial. Cada domini inclou una hèlix a curta seguida per una petita fulla b antiparal·lela girada i presenta una alta homologia estructural enfront proteïnes de la família de les b-defensines. El TCI s'ancora a la superfície de les carboxipeptidases de mamífer en un mode d'unió doble que no s'havia observat abans per cap altre inhibidor de carboxipeptidases.<br/>En el tercer treball s'examina la contribució de cadascun dels aminoàcids del lloc d'unió secundari de l'inhibidor de carboxipeptidases de patata (PCI) de cara a les propietats generals d'aquesta proteïna. Els estudis estructurals i enzimàtics demostren que el posicionament correcte del lloc d'unió primari per una unió i inhibició eficient de la carboxipeptidasa A depèn significativament del lloc d'unió secundari. A més, l'estudi comparatiu del plegament oxidatiu d'una sèrie de mutants del PCI utilitzant una aproximació de captura dels ponts disulfur indiquen que les forces no covalents dirigeixen el replegament d'aquesta petita proteïna rica en ponts disulfur a l'etapa de "reshuffling", que és el pas limitant del procés de plegament del PCI.<br/>En el quart treball s'ha determinat els camins de plegament oxidatiu i desplegament reductor de l'inhibidor de carboxipeptidases de sangonera (LCI). L'LCI reduït i desnaturalitzat és replega ràpidament a través d'un flux seqüencial d'espècies amb un, dos, tres i quatre ponts disulfur fins assolir la forma nativa. Dins dels intermediaris de plegament de l'LCI hi trobem dues espècies predominants de tres ponts disulfur (anomenades III-A i III-B) i una població heterogènia d'isòmers "scrambled" (quatre ponts disulfur no natius) que s'acumulen consecutivament al llarg de la reacció de plegament. Aquest estudi revela que les formes III-A i III-B contenen exclusivament ponts disulfur natius i corresponen a espècies estables i parcialment estructurades que s'interconverteixen entre elles assolint l'equilibri abans que la formació dels isòmers "scrambled" tingui lloc. <br/>En el cinquè treball s'ha purificat l'intermediari III-A directament de la reacció de plegament i se l'ha caracteritzat estructuralment per RMN. Els resultats mostren que aquesta espècie presenta una estructura força nativa, tot i que li manquen alguns elements d'estructura secundària per la qual cosa és més flexible que l'LCI natiu. III-A representa el primer exemple d'un intermediari "disulfide insecure" ("ponts disulfur insegurs") determinat estructuralment. L'oxidació directa d'aquesta espècie cap a la proteïna totalment nativa sembla estar restringida per l'enterrament de les seves dues cisteïnes dins d'una estructura semblant a la nativa. També s'han utilitzat aproximacions teòriques basades en constriccions topològiques que prediuen força bé la presència d'aquest intermediari de plegament. <br/>L'últim treball d'aquesta tesi tracta sobre l'altre intermediari majoritari de plegament de l'LCI. En aquest treball s'ha construït i analitzat extensivament un anàleg d'aquest intermediari. Els resultats obtinguts mostren que aquesta proteïna presenta una estructura global i una activitat semblants a les de la forma salvatge de l'LCI. A més, presenta un procés de plegament més ràpid i eficient que l'LCI salvatge. Tanmateix, aquest anàleg està fortament desestabilitzat, fet que indica que el quart pont disulfur dóna alta estabilitat i especificitat estructural a l'LCI.

The present thesis consists of six independent research works that are situated in the field of metallocarboxypeptidase inhibitors: their folding, stability, structure and function are studied. <br/>The first work comprises the isolation and cDNA cloning of a new carboxypeptidase inhibitor from ticks, named TCI. The studies performed on the recombinant form of TCI indicate that this protein is strongly constrained by its disulfide bonds, being unusually stable over a wide pH range and highly resistant to denaturing conditions. As a tight binding inhibitor of TAFIa, TCI stimulates fibrinolysis in vitro and thus may have potential for applications to prevent or treat thrombotic disorders.<br/>The second work presents the crystal structure of TCI in complex with either bovine carboxypeptidase A or human carboxypeptidase B. The structure of TCI consists of two domains that are structurally similar despite the low degree of sequence homology. The domains, each consisting of a short a-helix followed by a small twisted antiparallel b-sheet, show high structural homology to proteins of the b-defensin-fold family. Also, TCI anchors to the surface of mammalian carboxypeptidases in a double-headed manner not previously seen for carboxypeptidase inhibitors. <br/>In the third part, the role of each residue of the secondary binding site of potato carboxypeptidase inhibitor (PCI) in the folding, structure and function of this protein is determined. Structural and enzymatic studies demonstrate that the proper positioning of the primary site for efficiently binding and inhibition of carboxypeptidase A is significantly dependent on such a secondary contact region. In addition, a comparative study of the oxidative folding of several PCI mutants indicates that noncovalent forces drive the refolding of this small disulfide-rich protein at the reshuffling stage, the rate-limiting step of the process. <br/>The fourth work elucidates the oxidative folding and reductive unfolding pathways of leech carboxypeptidase inhibitor (LCI). Reduced and denatured LCI refolds rapidly through a sequential flow of 1-, 2-, 3-, and 4-disulfide (scrambled) species to reach the native form. Folding intermediates of LCI comprise two predominant 3-disulfide species (III-A and III-B) and a heterogeneous population of scrambled isomers that consecutively accumulate along the folding reaction. Our study reveals that forms III-A and III-B exclusively contain native disulfide bonds and correspond to stable and partially structured species that inter-convert, reaching an equilibrium prior to the formation of the scrambled isomers. <br/>In the fifth work, the III-A intermediate is directly purified from the folding reaction and structurally characterized by NMR spectroscopy. The data shows that this species displays a highly native-like structure although it lacks some secondary structure elements being more flexible than native LCI. III-A represents the first structurally determined example of a disulfide insecure intermediate; direct oxidation of this species to the fully native protein seems to be restricted by the burial of its two free cysteine residues inside a native-like structure. We show also that theoretical approaches based on topological constrains predict with good accuracy the presence of this folding intermediate. <br/>The last work of this thesis deals with the other major folding intermediate of LCI: III-B intermediate. In this work, an analog of this intermediate is constructed and extensively analyzed. The derived data shows that this protein displays the same overall structure, a similar activity, a faster and more efficient folding process than wild-type LCI, but a lower stabilization, which indicates that the fourth disulfide bond provides LCI with both high stability and structural specificity.