Aplicaciones de LC-MS/MS en la determinación de residuos de plaguicidas y drogas de abuso en muestras de latinoamérica. Énfasis en la problemática analática del glifosato

Abstract

<p>El modelo de agricultura actual requiere del uso de plaguicidas para mantener la producción a los niveles exigidos por una población mundial que está en continuo aumento. A pesar de sus numerosos detractores, el uso de plaguicidas es muchas veces inevitable, por lo que es habitual encontrar residuos de estos compuestos en productos vegetales y en el medio ambiente. El establecimiento de Límites Máximos de Residuos (MRLs) es uno de los aspectos más importantes en el proceso de autorización de productos fitosanitarios. Para vigilar el cumplimiento de MRLs en alimentos, es necesario implantar rigurosos programas de control, principalmente en productos vegetales. Para ello, se debe disponer de metodologías analíticas avanzadas, apropiadamente validadas, que sean capaces de detectar, identificar y cuantificar todo tipo de plaguicidas a niveles de concentración del orden de (sub)mg/kg. Los métodos analíticos deben incluir también metabolitos relevantes cuando están contemplados en la definición de residuo. Los acoplamientos cromatografía (tanto de gases como de líquidos)/espectrometría de masas son absolutamente fundamentales para este fin.</p> <p>Los MRLs surgen como una exigencia de la sociedad actual, y son de obligado cumplimiento. Pero muchas veces suponen una verdadera traba comercial, sobretodo en el mercado internacional, pues la superación de un MRL hace que el producto exportado no pueda comercializarse, debiendo ser destruido o devuelto a su país de origen. Por ello, es importante que todos los productos vegetales cuenten con los estudios requeridos para el establecimiento de MRLs, los cuales deben realizarse bajo los principios de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL). En ausencia de dichos estudios, se suele establecer un MRL por defecto, correspondiente al límite de cuantificación (LOQ) del método analítico propuesto por el fabricante. En la práctica, esto implica que, si el plaguicida se aplica sobre el cultivo en cuestión, será muy probable que queden residuos y que se supere el MRL. Esta situación afecta a muchas frutas tropicales de Latinoamérica para las que los MRLs se han estimado por extrapolación a partir de frutas semejantes o bien se han fijado por defecto en el LOQ del método. La ausencia de metodologías analíticas para frutas tropicales es un hándicap importante, tanto para el establecimiento de MRLs como para el control de residuos en productos de consumo doméstico, y también en los destinados a la exportación.</p> <p>En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado metodología analítica avanzada para frutas tropicales de elevado consumo en Colombia y de alto interés en sus exportaciones. Además de los métodos desarrollados para frutas tropicales, se ha trabajado también en la determinación de plaguicidas en suelos latinoamericanos. Una parte importante de la Tesis se ha centrado en la problemática analítica del glifosato, el herbicida más utilizado del mundo, cuyas dificultades analíticas son bien conocidas. La técnica usada en todos los trabajos ha sido cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con analizador de triple cuadrupolo, considerada técnica de referencia en la actualidad para la determinación de plaguicidas y metabolitos/productos de transformación, la mayoría de los cuales son de polaridad media-alta y baja volatilidad, adecuados, por tanto, para ser abordados por esta técnica.</p> <p>Después de una Introducción General (Capítulo 1), en la que se discuten diversos aspectos de interés sobre el tema tratado en la Tesis, el trabajo experimental se ha organizado en tres partes bien diferenciadas.</p> <p>En la primera parte (Capítulo 2), se desarrolla metodología multirresidual para la determinación de plaguicidas en frutas tropicales y en suelos de Latinoamérica. Los dos primeros trabajos corresponden al desarrollo y validación de métodos multirresiduo para frutas exóticas provenientes de Colombia, que son de vital importancia para el país pues gran parte de sus exportaciones agrícolas están centradas en este tipo de productos. De acuerdo con la bibliografía, la mayoría de frutas tropicales estudiadas no disponían de métodos publicados para residuos de plaguicidas. En esta Tesis se pretende que los métodos sean sencillos y rápidos, con la menor manipulación de muestra posible, con el objeto de minimizar errores analíticos, y poderlos transferir fácilmente a laboratorios de Latinoamérica. En el primer método (artículo científico 1) se escogió una extracción con acetonitrilo, usando trituración/homogeneización con Ultraturrax. El LOQ objetivo (nivel más bajo validado con muestras fortificadas sometidas al proceso analítico completo) fue 0.05 mg/kg. El método se desarrolló para 29 plaguicidas en siete frutas tropicales (uchuva, maracuyá, pitahaya, tamarillo, gulupa, papaya y granadilla). En el segundo método (artículo científico 2), se amplió el número de matrices tropicales hasta doce, añadiendo cinco más de frecuente consumo en Colombia (lulo, carambolo, feijoa, mangostán y guayaba). El número de compuestos estudiados se redujo a 20, considerando los más detectados en el primer estudio y también metabolitos incluidos en la definición de residuo. Para la extracción se aplicó el procedimiento QuEChERS, en su versión Europea (CEN 2009), basada en el uso de tampón citrato. El objetivo fue rebajar el LOQ hasta 0.01 mg/kg, que es el valor más bajo incluido normalmente en los MRLs.</p> <p>En ambos trabajos, se prestó especial atención al estudio del efecto matriz y a posibles estrategias para una corrección sencilla y de fácil aplicación en laboratorios de rutina. Se propusieron dos procedimientos para su corrección: 1) calibrado en matriz, agrupando varias tipos de muestras y escogiendo una de ellas como matriz representativa para la preparación de la curva de calibrado (gulupa, pitahaya y tamarillo se analizaron usando calibrado en matriz de gulupa; maracuyá, papaya y granadilla, usando calibrado de maracuyá; y uchuva, usando su propio calibrado en matriz); 2) calibrado en solvente, aplicando factores de corrección para cada combinación analito/matriz, basados en las diferencias de pendientes entre calibrado en matriz y calibrado en solvente.</p> <p>En ambos métodos, se procedió a la validación a los niveles de LOQ y 10xLOQ con resultados satisfactorios para la mayoría de plaguicidas y matrices (recuperaciones entre 70 y 120%, RSD < 20%). Por último, los métodos desarrollados se aplicaron al análisis de muestras reales, introduciendo numerosas muestras control de calidad (QC) para asegurar la robustez y fiabilidad del método en su aplicación al análisis de estas muestras.</p> <p>Este capítulo finaliza con el desarrollo de metodología analítica multirresiduo para suelos agrícolas de Argentina, siguiendo la misma filosofía de trabajo en cuanto al tratamiento de la muestra (artículo científico 3). En colaboración con el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) de Balcarce (Argentina), se seleccionaron 18 plaguicidas de amplio uso en Argentina y se estudiaron 11 suelos representativos de ese país. Se empleó una sencilla extracción sólido-líquido con acetonitrilo usando agitación mecánica seguida de ultrasonidos. Después de una centrifugación, el extracto del suelo se diluyó x 2 con H2O y se inyectó directamente en el sistema LC-MS/MS. En este trabajo se evaluó el efecto matriz para los 11 suelos estudiados. El método se validó satisfactoriamente a 0.5 y 0.05 mg/kg, siendo este último el LOQ objetivo del método. La cuantificación se llevó a cabo mediante calibrado externo con patrones en solvente. En su aplicación a los suelos objeto de estudio, se incluyeron QCs para cada suelo analizado. Las recuperaciones de los QCs fueron satisfactorias en la gran mayoría de combinaciones analito/suelo. Con ello, la metodología desarrollada fue testada y validada demostrando su «universalidad» para suelos muy diferentes, con notables variaciones en sus características físico-químicas.</p> <p>En todos los métodos multirresiduo desarrollados en este capítulo, se adquirieron dos transiciones por compuesto y se evaluaron las relaciones de intensidad (ion ratio), con el fin de asegurar la correcta identificación de los compuestos detectados en las muestras.</p> <p>En la segunda parte de la Tesis (Capítulo 3) se aborda la problemática analítica del herbicida glifosato en suelos latinoamericanos, por un lado, y en productos vegetales (principalmente cereales), por otro. Los trabajos llevados a cabo en suelos condujeron a la publicación de un artículo (artículo científico 4), cuyo objetivo fue desarrollar un método rápido, robusto y mejorado para residuos de glifosato y su principal metabolito AMPA en suelos complejos, con altos contenidos de materia orgánica. Las muestras estudiadas fueron tomadas de Argentina y Colombia, países en los que este herbicida es utilizado con regularidad para el control de malezas y/o para la erradicación de cultivos ilícitos de coca. Cabe destacar que en Argentina la soja transgénica, resistente al glifosato, representa la práctica totalidad de la soja cultivada, con lo que el consumo de glifosato, principalmente mediante aplicaciones aéreas, es muy elevado.</p> <p>El análisis de suelos se realizó sobre la base de los trabajos previos de nuestro grupo, en lo relativo a la extracción y a las condiciones de derivatización con FMOC. La investigación se centró en la etapa de clean-up, la cual resultó crítica debido al fuerte efecto matriz observado en estos suelos (supresión de ionización del orden del 90%, e incluso mayor), que no se había observado en los suelos españoles analizados hasta entonces. Para ello, se aplicó SPE probando dos tipos de sorbentes (Oasis MAX y HLB), a diferentes pH, antes y después de la derivatización con FMOC. Los mejores resultados se obtuvieron con Oasis HLB, realizando el clean-up del extracto del suelo antes de derivatizar con FMOC, previo ajuste a pH 9. En estas condiciones, tanto glifosato como AMPA, pasaron a través del cartucho Oasis HLB sin sufrir retención, y la derivatización se realizó sobre el eluato no retenido después de pasar por el cartucho de SPE. El uso de patrón interno marcado de glifosato fue fundamental para poder cuantificar correctamente. El método se validó en cuatro suelos, dos Argentinos y dos Colombianos, a dos niveles de concentración (0.5 y 5.0 mg/kg). El límite de cuantificación (LOQ) objetivo fue 0.5 mg/kg.</p> <p>Se analizaron 26 suelos de diferentes áreas de Colombia (15) y Argentina (11). Para garantizar la calidad de los análisis se intercalaron varias muestras QC, cuyas recuperaciones fueron en general satisfactorias. Los suelos Colombianos fueron particularmente problemáticos, especialmente para el AMPA, para el que no se cumplía la relación de intensidades entre las transiciones adquiridas (Q/q) en varias muestras. Ambos compuestos se detectaron en el 90% de las muestras, encontrándose las concentraciones más altas en los suelos de Colombia. Todos los positivos se confirmaron usando, al menos, dos transiciones MS/MS, siendo necesario que la relación Q/q y el tiempo de retención estuvieran dentro de las tolerancias máximas admitidas en las guías SANCO. Se observó que en varios suelos las transiciones medidas estaban interferidas por componentes co-extraídos, por lo que fue importante adquirir todas las transiciones posibles, con el fin de disponer de alternativas en caso de interferencias. La situación del AMPA fue aún más problemática en términos de confirmación, ya que tan sólo se pudieron optimizar dos transiciones, y una de ellas (la de cuantificación) estaba interferida en la mayoría de las muestras, hecho que dificultó en gran medida los análisis. En nuestro trabajo se sugiere aumentar la tolerancia en la relación Q/q hasta 50%, como valor más realista para la identificación en este tipo de análisis.</p> <p>En el segundo trabajo (artículo científico 5) se desarrolla metodología analítica para la determinación de residuos de glifosato en cereales y soja. El trabajo se centró exclusivamente en glifosato, ya que en la definición de residuos propuesta por la EFSA no incluye su principal metabolito AMPA. El objetivo principal fue evitar la etapa de derivatización, intentando la determinación directa del herbicida. Para ello, se probaron diferentes columnas de LC, seleccionando finalmente la mix-mode Obelisc N, que fue la que proporcionó mejor retención para este compuesto. Las matrices objeto de estudio se seleccionaron entre las de mayor interés por la posible presencia de este compuesto (arroz, soja y maíz), y que además se encuentran entre las de mayor uso en transgénicos resistentes al glifosato. La metodología desarrollada también se aplicó a muestras de trigo, maíz, gluten de maíz y guisantes.</p> <p>Este trabajo fue encaminado a realizar el menor tratamiento posible de muestra, intentando alcanzar un compromiso entre efecto matriz aceptable y menor tiempo de análisis. La extracción del glifosato en las muestras se hizo con agua mediante ultrasonidos. En matrices con alto contenido en grasa (maíz, soja) se añadió una partición liquido-liquido con diclorometano y, en el caso de la soja, se procedió a la eliminación de las proteínas mediante precipitación con acetonitrilo. Como en el resto de trabajos realizados en la Tesis, se dedicó especial atención al estudio del efecto matriz, que fue notorio en las matrices de maíz y soja, con fuertes supresiones de señal.</p> <p>La metodología desarrollada se validó a dos niveles de concentración, con LOQ objetivos de 0.1 mg/kg para arroz y maíz, y 2 mg/kg para soja, valores altos pero suficientes para controlar el cumplimiento de MRLs en la Unión Europea. El uso del patrón interno marcado fue clave para la cuantificación correcta del analito, al corregir el efecto matriz aún observado después del tratamiento de muestra, especialmente en soja y maíz.</p> <p>La ventaja de este método es que no resulta necesaria una etapa previa de derivatización, pero su principal inconveniente es la poca robustez y rápida degradación observada en la columna Obelisc N, más evidente a mayor complejidad de la matriz inyectada (ej. soja). Este hecho, unido a su elevado precio, hace que, de momento, este método sea poco atractivo para análisis de rutina, a pesar de proporcionar resultados analíticos satisfactorios. Cabe esperar que, en un futuro próximo, aparezcan nuevas columnas, más robustas y menos costosas, que permitan la separación cromatográfica del glifosato sin los inconvenientes mencionados.</p> <p>Finalmente, para completar el trabajo con la técnica LC-MS/MS y ampliar su campo de aplicación a nivel de residuos, en la tercera parte de esta Tesis se ha abordado (Capítulo 4) la determinación de drogas de abuso en aguas residuales urbanas (cocaína, su principal metabolito benzoylecgonine (BE), anfetamina, metanfetamina, el principal metabolito del cannabis 11-nor-9-tetrahidrocannabinol-9-carboxilic acid (THC-COOH), ketamina, 6 Monoacetylmorphine (6 MAM) y 3,4-methylen-dioxy-metamphetamine (MDMA, éxtasis). En este caso, se hizo uso de metodología analítica ya desarrollada por nuestro grupo de trabajo, por lo que la investigación se centró en el tratamiento e interpretación de los resultados obtenidos en el análisis de aguas residuales (influente urbano) de las ciudades de Castellón y Murcia, por un lado, y Bogotá y Medellín, por otro. El objetivo del trabajo fue determinar los niveles de concentración de drogas en las aguas y, a partir de los resultados obtenidos, estimar la carga diaria de estas drogas en las aguas residuales de estas poblaciones. En aquellos casos en los que se disponía de información suficiente y contrastada sobre la excreción del metabolito/biomarcador en orina, se pudo hacer una estimación del consumo de droga en la población (caso de la cocaína y su metabolito BE). Este tipo de estimaciones se enmarcan en lo que se conoce como epidemiología de las aguas residuales (Wastewater-Based Epidemiology, WBE).</p> <p>Los resultados obtenidos en esta Tesis mostraron que en todas las ciudades los niveles más altos, con diferencia, correspondían a la BE, con muchas muestras superando los 1000 ng/L (1 ppb). Las concentraciones de BE fueron más altas en las aguas residuales de Colombia, que también presentaron unos niveles altos de cocaína, considerablemente superiores a los de las dos ciudades españolas. Cabe destacar los niveles relativamente altos de THC-COOH, cuyas concentraciones en las aguas de las ciudades españolas y colombianas fueron bastante similares (concentraciones en general entre 100 y 300 ng/L). Además de estas dos drogas, que parecen ser las más consumidas por la población, se detectó MDMA en la mayoría de muestras, a concentraciones por debajo de 30 ng/L, excepto en el fin de semana en Bogotá en donde alcanzó los 60 ng/L. La ketamina sólo se detectó en las muestras de Colombia, en concentraciones inferiores a 30 ng/L.</p> <p>Se pudo estimar el consumo medio de cocaína a partir de los datos de BE en las aguas residuales teniendo en cuenta su excreción media en orina. El valor estimado para Castellón (550 mg/día/1000h) y Murcia (850) fue semejante al reportado en estudios realizados en 2011 para ciudades españolas. El consumo en Bogotá pareció encontrarse también en esta misma línea (750), por debajo de ciudades europeas como Amberes o Ámsterdam, en donde llega hasta casi 2000 mg/día/1000h. Sin embargo, Medellín estuvo por encima de todas las ciudades europeas, con un valor medio de 3000 mg/día/1000h.</p> <p>En cuanto al cannabis, las cargas medias encontradas para su biomarcador THC-COOH en las aguas residuales fueron semejantes en las cuatro ciudades estudiadas (entre 33 y 49 mg/día/1000h). Estos valores son del mismo orden que los encontrados en Milán, Bratislava, Sarajevo, Zagreb, Amberes, Bruselas, Praga o Valencia, pero inferiores a los de Barcelona, París, Eindhoven, Utrecht o Ámsterdam, todos ellos con cargas próximas o ligeramente superiores a 100 (200 en el caso de Ámsterdam, ciudad en la que es conocida su política liberal en el consumo de cannabis).</p> <p>Las cargas medias de MDMA fueron bajas en comparación con las de cannabis y BE, y semejantes en las cuatro ciudades (valores medios entre 1.5 y 4.4 mg/día/1000h). Estos resultados están en la línea de los reportados en ciudades como Zagreb, Milán, Oslo, Valencia, Castellón o Santiago, y son significativamente inferiores a los reportados en Barcelona, Amberes, Zúrich, Londres o Ámsterdam, ciudades en las que frecuentemente se superan los 30-50 mg/día/1000h.</p> <p>La ketamina tan sólo se detectó en las aguas de Colombia, en las dos ciudades estudiadas Bogotá y Medellín, con valores medios de 3.8 y 1.5 mg/día/1000h, respectivamente.</p> <p>Cabe destacar que los datos obtenidos en esta Tesis son los primeros reportados en la bibliografía sobre ciudades de Colombia.</p>