Estudi funcional de la butanodiol deshidrogenasa (Bdh1p) de Saccharomyces cerevisiae. Aplicacions biotecnològiques a la indústria cervesera

Abstract

La seqüenciació del genoma de Saccharomyces cerevisiae al 1996 va revelar que el 60% dels aproximadament 6000 gens del llevat codificaven per proteïnes de funció desconeguda. Donat que el nostre laboratori investiga l'estructura i funció d'enzims de la superfamíla de les deshidrogenases/reductases de cadena mitja (MDR), vàrem realitzar una búsqueda en el genoma del llevat de possibles membres MDR encara no caracteritzats. Es van identificar 12 ORFs, dels quals 5 eren de funció desconeguda. La present tesi doctoral ha estudiat la funció de l'enzim codificat per un d'aquests gens, el YAL060W.<br/>S'ha clonat i expressat el gen YAL060W de S. cerevisiae per determinar l'activitat del seu producte gènic. El gen YAL060W, que s'ha anomenat BDH1, codifica per una butanodiol deshidrogenasa: la Bdh1p. Aquest enzim pertany a la superfamília enzimàtica de les MDR i és la primera butanodiol deshidrogenasa d'aquesta superfamília descrita en un organisme eucariòtic.<br/>Els principals substrats de l'enzim són l'acetoïna i el 2,3-butanodiol, i a més, és estereoespecífic pels isòmers d'aquests substrats en configuració R. Altres substrats de l'enzim són el diacetil i la 2,3-pentanodiona, a més de compostos amb grups diol, dicetona o hidroxicetona contigus. La Bdh1p és un enzim específic pel coenzim NAD(H). <br/>La Bdh1p s'expressa preferencialment a la fase estacionària quan s'esgota la glucosa del medi, així com quan es creix el llevat en fonts de carboni com l'etanol o la galactosa. <br/>S'ha identificat un altre enzim actiu amb diacetil i NADH en els homogenats de S. cerevisiae que ha resultat ser l'alcohol deshidrogenasa II (Adh2p). Aquest enzim és també actiu amb 2,3-pentanodiona, però no ho és amb acetoïna o 2,3-butanodiol. La reducció d'aquests compostos també és estereoespecífica però pels grups en configuració S.<br/>Durant la fermentació, S. cerevisiae produeix i acumula acetoïna i 2,3-butanodiol. La Bdh1p és la responsable de la producció de l'isòmer (2R,3R)-2,3-butanodiol. La deleció del gen BDH1 elimina l'acumulació d'aquest compost al medi així com l'activitat acetoïna reductasa en homogenats de llevat crescut en glucosa. Per tant, durant la fermentació alcohòlica la Bdh1p reduiria l'acetoïna sintetitzada a partir d'acetaldehid per la piruvat descarboxilasa, produint el 2,3-butanodiol. La Bdh1p seria l'enzim responsable d'aquesta branca secundària del metabolisme fermentatiu, que podria contribuir a regular el balanç redox de manera fina. <br/>En canvi la deleció dels gens ADH2 i YAL061W (amb un 51% d'identitat seqüencial amb el BDH1) no afecten al patró d'excreció del butanodiol, però es veu reduïda l'activitat diacetil reductasa en un 58% en fase exponencial i un 34% a la fase estacionària.<br/>Diacetil i 2,3-pentanodiona, també anomenats VDKs, són compostos organolèptics indesitjables que es produeixen durant la fabricació industrial de cervesa i que són eliminats durant un llarg període de maduració. Les VDKs són substrats de la Bdh1p, el que donava la possibilitat de que soques de llevat que sobreexpressessin la Bdh1p acceleressin l'eliminació d'aquests compostos i poguessin reduir el temps de maduració de la cervesa. Per això es va sobreexpressar la Bdh1p sota el control del promotor ADH1 en la soca industrial cervesera SID amb vectors centromèrics i multicòpia. Aquestes soques disminuïen, en certes condicions, l'acumulació de VDKs durant la fermentació del most. També es va modificar genèticament la mateixa soca industrial per tal de sobreexpressar la Bdh1p de manera estable, però la fermentació de most industrial amb aquesta soca modificada no va afectar els nivells d'acumulació de VDKs al medi. Les aplicacions biotecnològiques es varen estudiar amb la participació de l'empresa S.A. Damm.

The sequencing of the genome of the yeast Saccharomyces cerevisiae finished in 1996, revealing that approximately 60% of their 6000 genes, coded for proteins of unknown function. As our laboratory is interested in the relationship between the structure and function of medium chain dehydrogenases/reductases (MDR), we screened the yeast genome for MDR members uncharacterised until then. We identified 12 ORFs, 5 of which were of unknown function. The present doctoral thesis presents the studies carried out with the enzyme encoded by one of those genes, YAL060W.<br/>The YAL060W gene from S. cerevisiae has been cloned and expressed in a yeast vector. The gene, that we have named BDH1, codes for a butanediol dehydrogenase: Bdh1p. This enzyme is the first butanediol dehydrogenase described in an eukaryote, belonging to the MDR superfamily.<br/>Acetoin and 2,3-butanediol are the best substrates for the enzyme, that is stereoespecific for the oxidation of the R isomers of the diol and for the reduction of the acetoin yielding a centre with an R configuration. Other substrates for the enzyme are diacetyl and 2,3-pentanodione, and also those compounds containing vicinal diol, diketone or hydroxy-ketone groups. Bdh1p is extremely specific for NAD(H) as coenzyme.<br/>Bdh1p is induced in the stationary phase when yeast has exhausted the glucose from the medium. It is also expressed in yeasts grown in ethanol or galactose as carbon sources.<br/>We identified another enzyme active with diacetyl and NADH in S. cerevisiae extracts that turned out to be alcohol dehydrogenase II (Adh2p). Adh2p is also active with 2,3-pentanedione, but not with acetoin or 2,3-butanediol. Reduction of these compounds is also stereospecific, but yielding an hydroxyketone with an S configuration.<br/>All the stereoisomers of 2,3-butanediol and acetoin are produced by S. cerevisiae during fermentation, being Bdh1p responsible of the production of (2R,3R)-2,3-butanediol. Deletion of the BDH1 gene eliminates the excretion of (2R,3R)-2,3-butanediol, resulting in an accumulation of R-acetoin. So, during alcoholic fermentation Bdh1p reduces acetoin, synthesised by pyruvate decarboxylase from acetaldehyde, to 2,3-butanediol. By its presence in this secondary fermentative pathway, Bdh1p can contribute to the regulation of the redox balance in yeast.<br/>Deletion of the ADH2 andYAL061W (with a 51% of sequence identity with BDH1) genes, results in a substantial decrease of the diacetyl reductase activity (58% in the exponential phase and 34% in the stationary phase), although doesn't affect the proportion of butanediol isomers excreted during alcoholic fermentation.<br/>Diacetyl and 2,3-pentanedione, also called VDKs, have unpleasant organoleptic properties above a certain threshold, and are produced during the industrial production of beer. The concentration of both compounds needs to be reduced during a long maturation time. Since VDKs are substrates of Bdh1p, we hypothesized that yeast strains overexpressing Bdh1p could accelerate the elimination of these compounds, resulting, then, in a shortenig of the maturation step in beer production. We overexpressed Bdh1p under the control of the ADH1 promoter by using centromeric and multicopy vectors in an industrial beer yeast strain, called SID. The overexpression of Bdh1p from yeast expression vectors in the industrial strain, reduced, in some conditions, the accumulation of VDKs during must fermentation. In order to overexpress Bdh1p in a stable way, we then inserted the Bdh1p construct in the SID genome, but must fermentation with this strain did not result in reduced levels of VDKs. These biotechnological applications were done in collaboration with the firm S.A. DAMM.