Paper de les Aldo-Ceto reductases en el metabolisme de retinoides: estudi funcional i estructural de l'AKR1B10

Abstract

Per primer cop, el nostre grup va identificar un enzim de la superfamilia de les aldo-ceto reductases (AKR) actiu amb retinoides. Atès que l'AKR1B12 presenta una identitat seqüencial pròxima al 70% amb l'AKR1B1 i l'AKR1B10 humanes, es va decidir ampliar l'estudi de l'activitat retinoide oxidoreductasa entre les AKR. <br/>En la present Tesi Doctoral, hem aprofundit en l'estudi de l'activitat retinal reductasa de membres de la superfamilia de les aldo-ceto reductases (AKR). El treball es va iniciar amb la caracterització in vitro de l'activitat amb retinoides d'AKR humanes de la família AKR1. En col·laboració amb el grup de la Dra. Natalia Kedishvili (actualment en el Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Schools of Medicine and Dentistry, University of Alabama at Birmingham, EUA) es va realitzar una anàlisi comparativa de l'activitat retinol oxidoreductasa d'enzims de les superfamílies de les deshidrogenases/reductases de cadena mitjana (MDR), deshidrogenases/reductases de cadena curta (SDR) i AKR. Es va emprar un nou mètode basat en la solubilització de retinoides amb BSA, i anàlisi mitjançant HPLC. Així, es van poder determinar els valors de les constants cinètiques per a enzims humans de les tres superfamílies sense l'efecte d'inhibició del Tween-80, detergent utilitzat tradicionalment per a l'estudi cinètic de les MDR i AKR (Capítol I). Aquests resultats van posar de relleu que el valor de Km per a retinoides és similar (0,1-1 &#956;M) en els enzims estudiats. Les principals diferències es centren en el valor de kcat, el qual va variar fins a tres ordres de magnitud entre els diferents enzims. Un altre resultat destacable, va ser la desmostració que cap dels enzims era capaç d'utilitzar com a substrat retinol, o retinal, unit a la proteïna cel·lular unidora de retinol (CRBPI). Fins el present treball, s'utilitzaven dos arguments per defensar un paper principal de les SDR en l'oxidació de retinol a retinal, primera etapa de síntesi de l'àcid retinoic: 1) Valors de Km inferiors de les SDR per als retinoides (fins a dos ordres de magnitud respecte les ADH). 2) Capacitat de reconèixer l'holoCRBPI com a substrat, una propietat aparentment exclusiva d'algunes SDR. El nostre estudi, a part de descartar aquests dos arguments, ha introduït les AKR com a tercer grup enzimàtic implicat en el metabolisme de retinoides. <br/>La segona part de la Tesi es centra en l'estudi estructural i funcional de l'AKR1B10, l'AKR que presenta una major eficiència catalítica per a la reducció del retinal. Aquest enzim és sobrexpressat en diferents tipus de càncers humans, el que va fer augmentar el nostre interès per determinar el seu paper en la ruta de síntesi de l'àcid retinoic. A part de l'estudi in vitro de l'activitat retinoide oxidoreductasa de l'enzim, també es va dur a terme un estudi in vivo. Utilitzant cèl·lules COS-1 com a model, i mitjançant transfecció transitòria, es va poder observar que AKR1B10 també participava en la reducció de retinal in vivo, però que en canvi no era capaç d'oxidar retinol. <br/>Finalment, i en col·laboració amb el grup de cristal·lografia de proteïnes del Dr. Ignasi Fita (Parc Científic de Barcelona-CSIC), es va obtenir l'estructura tridimencional del complex ternari AKR1B10-NADP+-tolrestat. El tolrestat és un inhibidor d'AKR1B1 àmpliament estudiat com a fàrmac en el tractament de les complicacions de la diabetis, però que també inhibeix AKR1B10 tant in vitro com in vivo. Tot i l'elevada identitat seqüencial entre AKR1B1 i AKR1B10, aquests enzims presenten constants cinètiques molt diferents per a la reducció del retinal. Així, gràcies a la resolució de l'estructura d'AKR1B10, esperem poder estudiar els determinants estructurals que confereixen a cada enzim les seves propietats cinètiques característiques, així com establir les bases per al disseny de nous inhibidors específics per a cadascun d'ells.

Our group was the first to identify an enzyme from the aldo-keto reductase (AKR) superfamily, AKR1B12, active with retinoids (Crosas et al., 2001). Due to the fact that AKR1B12 shows a 70% sequence identity with the human enzymes AKR1B1 and AKR1B10, we decided to study more deeply the retinoid oxidoreductase activity within the AKRs.<br/>Here, we extended the study on the retinal reductase activity of AKR superfamily members. The work was initiated with the in vitro characterization of retinoid activities of human AKRs from the AKR1 family. In collaboration with Dr Natalia Kedishvili's group (Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Schools of Medicine and Dentistry, University of Alabama at Birmingham, USA) we carried out a comparative analysis of retinol oxidoreductase activity of the enzymes from the medium chain dehydrogenases/reductases (MDR), short chain dehydrogenases/reductases (SDR) and AKR. A new method based on a retinoid solubilisation with BSA and analysis by HPLC was employed. Kinetic constant values were determined for human enzymes from the three superfamilies, without the inhibitory effect of Tween-80, a detergent traditionally employed for MDR and AKR kinetic studies. The Km values obtained with retinoids (0,1-1 &#956;M) were similar for all the enzymes tested. Main differences were found in the kcat values, which varied up to 10000-fold between the studied enzymes. Furthermore, none of the studied enzymes was able to use retinol, nor retinal, bound to cellular retinol binding protein (CRBPI). So far, a major role for SDR in retinol oxidation was supported by: 1) SDR had lower reported Km values with retinoid (up to 100-fold lower than ADHs). 2) SDR were the only enzymes with reported ability to recognize holoCRBPI as a substrate. Our group refused both arguments and introduced AKRs as the third enzymatic group implicated in retinoid metabolism.<br/>The second part of the thesis was focused on the structural and functional study of AKR1B10, which is the AKR with the highest catalytic efficiency reducing retinal. The enzyme is overexpressed in different human cancers, which increased our interest to determine its role in the retinoic acid synthesis pathway. In addition to the study on the retinoid oxidoreductase activity in vitro, we performed an in vivo study. COS-1 cells were used as a model, and transitional transfection experiments were carried out. We observed that AKR1B10 participates in the retinal reduction in vivo, but it was unable to oxidate retinol.<br/>Finally, in collaboration with Dr. Ignasi Fita's group (Parc Científic de Barcelona-CSIC), the threedimensional structure of the AKR1B10-NADP+-tolrestat complex was obtained. Tolrestat is an AKR1B1 inhibitor widely studied as a drug for diabetes treatment. It also inhibits AKR1B10 in vitro and in vivo. Despite the high sequential identity shared between AKR1B1 and AKR1B10, the two enzymes showed extremely different kinetic constant values for retinal reduction. The AKR1B10 structure resolution might help us to study structural features for the retinoid specificity showed, and to propose new fundamentals in order to design new specific inhibitors for each enzyme.