Estudi dels canvis estructurals de la permeasa de melibiosa d'Escherichia coli induïts per la unió dels substrats

Abstract

La permeasa de melibiosa (MelB) és un cotransportador de la membrana d'E. coli que permet l'acumulació d'&#945;- i &#946;-galactòsids gràcies a l'energia d'un gradient transmembrana de Na+, Li+ o H+. Es prediu una estructura secundària de 12 hèlixs transmembrana amb l'extrem N- i C-terminal en el cantó citoplasmàtic.<br/>L'objectiu d'aquest treball és l'obtenció d'informació estructural mitjançant espectres de diferència d'ATR-FTIR (infraroig per transformada de Fourier, reflexió total atenuada) on es resten dos espectres d'absorció en presència de diferents substrats de la MelB (Na+, Li+, H+ i melibiosa). La tècnica espectroscòpica de FTIR ens permet obtenir informació de l'estructura secundària i terciària de la MelB. A més, una característica important de la tècnica d'ATR-FTIR és que ens permet modificar el medi en que es troba la proteïna sense la necessitat de canviar de mostra.<br/>Els espectres de diferència indiquen canvis en estructures secundàries com: hèlix &#945; (probablement canvis en la inclinació de les hèlixs transmembrana), làmines &#946;, hèlixs 310, girs reversos i estructures desordenades. A més dels pics assignats a estructura secundària també s'observen una varietat de pics que poden correspondre a cadenes laterals com Asp, Glu, Asn, Trp i Tyr.<br/>La comparació dels espectres de diferència en D2O amb els obtinguts en H2O permet una millor assignació de l'estructura secundaria i, el que és molt interessant, la identificació de pics de residus com Asp i Glu. A partir d'aquests espectres es proposa que: 1) Les estructures involucrades en la unió de Na+ són més accessibles al solvent que aquelles que intervenen en la interacció amb la melibiosa en presència de Na+. 2) La unió de Na+ indueix uns canvis en la zona de vibració dels àcids carboxílics que deuen indicar una interacció d'aquests cations amb cadenes laterals d'Asp, que s'han proposat que formen part del lloc d'unió dels cations. En el següent pas, la interacció de melibiosa torna a induir uns canvis en la zona dels àcids carboxílics, on en aquest cas es poden assignar a un trencament de ponts salins entre les cadenes laterals d'Asp/Glu i Arg/Lys.<br/>Per tal d'aprofundir en l'estudi dels canvis conformacionals involucrats en les diferents etapes del transport es van realitzar els espectres de diferència del mutant R141C i de la MelB reaccionada amb el reactiu NEM (N-etilmaleimida). Aquestes dues permeases uneixen però no transporten els substrats, però fins a dia d'avui encara no està clar en quin pas bloquegen el transport dels substrats. El mutant R141C a més de la mutació de l'Arg consta de 4 mutacions més que corresponen a la substitució de les 4 Cys natives de la MelB per 3 Ser i una Val. Per tant, els espectres de diferència del mutant R141C es comparen amb els del mutant 3SV (permeasa sense Cys), que conserva aproximadament les mateixes propietats que la MelB salvatge a l'hora d'unir i transportar els substrats. Els espectres de diferència del mutant R141C són diferents que els espectres de diferència del mutant 3SV. En canvi, els espectres de diferència de la MelB reaccionada amb NEM són molt semblants als espectres de la MelB salvatge. Per tant, es dedueix que el mutant R141C té el seu transport bloquejat en un estat anterior del transport en comparació amb la MelB reaccionada amb NEM. En concret, és probable que el mutant R141C només uneixi els substrats, mentre que la MelB-NEM probablement queda bloquejada en l'estat que s'anomena "tancat" proposat pel transport simport.

Melibiose permease (MelB) is a co-transporter of Escherichia Coli that transports &#945;- and &#946;-galactosides to the cell interior coupled to the downhill electrochemical ion gradient of Na+, Li+, or H+. MelB secondary structure is predicted to consist of 12 transmembrane helices with the N- and C-terminal in the cytoplasmatic side.<br/>The objective of this work is to obtain structural information by means of difference spectra by ATR-FTIR (attenuated total reflection, Fourier transform infrared). This difference spectra result from subtraction of two consecutive absorbance spectra in the presence of different MelB substrates (Na+, Li+, H+ or melibiose). FTIR gives information about the secondary and tertiary structure of proteins. Furthermore, ATR-FTIR allows exchanging the external medium without changing the sample.<br/>Difference spectra show changes in secondary structures such as: &#945;-helix (likely due to changes in tilting), &#946;-sheet, helix 310, reverse turns and unordered structure. Furthermore, other peaks can be assigned to residues side chains such as Asp, Glu, Asn, Trp and Tyr.<br/>Difference spectra recorded in the presence of D2O, compared to those recorded in the presence if H2O, are useful to improve assignations of secondary structure and Asp and Glu residues. From these spectra it can be concluded that: 1) structures involved in Na+ binding are more accessible to the solvent than those involved in melibiose interaction in the presence of Na+. 2) Na+ binding induce changes in peaks in the carboxylic acids absorption region. These peaks may arise from the interaction of this cation with Asp, which have been proposed to form the cation binding site. In the next step of the transport mechanism, melibiose interaction also induces changes in carboxylic absorption region. These peaks can be assigned to the carboxylic side chains interacting with Arg and/or Lys residues in the resting state that become free upon melibiose binding.<br/>To get further understanding of the structural changes involved in the different steps of substrate transport, difference spectra of the R141C mutant and the MelB reacted with NEM (N-etylmaleimide) were recorded. Both permeases bind the substrates but do not translocate them. However, it is not clear where these permeases block the transport. The R141C mutant has in addition 4 other mutations. These mutations correspond to the 4 native Cys mutated to 3 Ser and 1 Val. For this reason R141C difference spectra are compared to those corresponding to the mutant 3SV (Cys-less), which has similar properties than the WT. R141C difference spectra are different than those corresponding to 3SV. On the other hand, difference spectra of MelB-NEM are quite similar to those recorded for the WT. Hence, R141C mutant has its transport blocked in an early step than the MelB-NEM. Particularly, it is proposed that R141C mutant only binds the substrate whereas MelB-NEM is blocked in the "closed" state proposed for the symport transport.