Estudio estructural y funcional de las cinamil alcohol deshidrogenasas de Saccharomyces cerevisiae

Abstract

En esta memoria se presenta la identificación y posterior estudio de las características cinéticas, estructurales y funcionales de dos nuevas alcohol deshidrogenasas de Saccharomyces cerevisiae con actividad dependiente de NADP(H). Ambos enzimas, que comparten un 64% de identidad, pertenecen a la superfamilia de alcohol deshidrogenasas de cadena media que unen zinc. Este trabajo se ha estructurado en capítulos en base a la publicación de los datos presentados. En el Capítulo I se presenta la identificación y caracterización de Adh6p con dos publicaciones referentes a la identificación del ORF YMR318C como el gen ADH6 y la siguiente determinación de las propiedades fisicoquímicas y cinéticas de Adh6p. Se trata de una proteína homodimérica compuesta por subunidades de 40 kD, activa con alcoholes primarios o aldehídos en presencia de NADP(H). <br/>En el Capítulo II se presenta la identificación y caracterización de Adh7p con una publicación en la que se identifica al ORF YCR105W como el gen ADH7. Las propiedades fisicoquímicas y cinéticas de Adh7p resultaron muy similares a las ya encontradas para Adh6p, ambas proteínas presentaban una amplia especificidad de sustratos, desde alcoholes/aldehídos alifáticos lineales y ramificados hasta alcoholes/aldehídos aromáticos. Tanto Adh6p como Adh7p son más eficientes para la reducción de aldehídos que para la oxidación de sus correspondientes alcoholes (aproximadamente 50-100 veces), por lo que preferentemente funcionaran como reductasas dependientes de NADPH. También se clasifica a estas dos alcohol deshidrogenasas como miembros de la familia de las cinamil alcohol deshidrogenasas, y dadas sus características de secuencia y de especificidad de sustrato, se las clasifica más concretamente dentro de la subfamilia de las CAD-emparentadas. <br/>En el Capítulo III se presenta la estructura tridimensional de Adh6p como publicación. La resolución de dicha estructura reveló el patrón característico de las ADHs de cadena media: la subunidad de Adh6p está estructurada en dos dominios, uno estructural y otro de unión al cofactor, separados por una profunda hendidura que aloja el centro de unión a sustrato. También se han identificado los dos iones de zinc, uno con función estructural coordinado por cuatro cisteínas (cisteínas 100, 103, 106 y 113) y otro con función catalítica, coordinado por la His68 y las Cisteínas 46 y 143, siendo el cuarto ligando una molécula de agua que será desplazada por el sustrato en la catálisis. La resolución de la estructura ha permitido identificar los residuos implicados en la unión al coenzima y al substrato. Los datos estructurales obtenidos ponen de manifiesto una heterogeneidad en la unión al coenzima. Al parecer, sólo una de las dos subunidades de Adh6p presenta una alta afinidad por el cofactor, datos que han sido ratificados por estudios de cuantificación de la estequiometría de la unión Adh6p-NADPH. Los datos obtenidos nos han permitido realizar una hipótesis sobre su mecanismo catalítico, que al parecer presenta 'half-of-the-sites reactivity'. <br/>En el Capítulo IV se presentan estudios no publicados sobre la función de Adh6p y Adh7p en la levadura. Se ha estudiado la implicación de estos enzimas en la asimilación de productos procedentes de la degradación de la lignina. Los estudios realizados demuestran que Adh6p es la responsable de la desintoxicación de estos productos. Adh7p también tendría un papel en la asimilación de estos aldehídos, pero sería tan solo un papel de apoyo. Los estudios realizados en condiciones de estrés oxidativo demuestran que Adh6p participa en la respuesta al estrés oxidativo. También se ha demostrado que Adh6p es la responsable de la reducción del 3-metilbutanal en la levadura. Finalmente, en estudios comparativos de la cepa silvestre con la cepa adh1? han demostrado la implicación de Adh6p en el mantenimiento intracelular del balance redox NADP+/NADPH.

In this Thesis we present the identification of two new NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenases from Saccharomyces cerevisiae and the study of their kinetic, structural and functional properties. Both enzymes share a 64% identity and belong to the zinc-containing medium chain alcohol dehydrogenase superfamily. These studies have been structured in four different chapters. <br/>In Chapter I we present the identification and characterization of Adh6p. This chapter contains two publications that refer to the identification of YMR318C ORF as ADH6, and the determination of the physicochemical and kinetic properties of the corresponding gene product, Adh6p. The enzyme is a homodimeric protein composed of 40 kD subunits, active towards primary alcohols or aldehydes using NADP(H) as coenzyme. <br/>In Chapter II, the identification and characterization of Adh7p is presented with one publication where the YCR105W ORF is identified as ADH7. Physicochemical and kinetic properties of Adh7p resulted quite similar to those from Adh6p. Both enzymes had a broad substrate specificity, ranging from linear and branches aliphatic alcohols/aldehydes to aromatic alcohols/aldehydes. Adh6p and Adh7p present catalytic efficiency for the reduction of aldehydes 50-100 times higher than the corresponding oxidation of alcohols, therefore, these enzymes would preferently function as NADPH-dependent reductases. These enzymes have been classified as alcohol dehydrogenases belonging to the cinnamyl alcohol dehydrogenase family. Given their sequence characteristics and their substrate specificity, their have been identify as members of the CAD-related subfamily. <br/>In Chapter III the resolution of the three-dimensional structure of Adh6p is introduced as a publication. The solved structured revealed the MDR characteristic patterns: Adh6p is structured in two domains, a structural domain and a binding cofactor domain, separated by a deep cleft that would contain the substrate binding site. We have identified two zincs per subunit, one with structural function coordinated by four cysteins (Cys100, Cys103, Cys106 and Cys113) and the other with catalytic function coordinated by His68 and Cysteins 46 and 143, being the fourth ligand a water molecule that would be displaced by the substrate during the catalytic cycle. The structure resolution has allowed us to identified the residues involved in coenzyme and substrate binding. The structural data obtained manifest and heterogeneity in coenzyme binding, where only one of the binding sites would present a high affinity for the coenzyme. This hypothesis is supported with stoichiometric quantification of Adh6p-NADPH binding experiments and has lead us to propose that Adh6p would present 'half-of-the-sites reactivity'. <br/>In Chapter IV we present not published studies about the function of Adh6p and Adh7p in the yeast. We have studied the implication of both enzymes in the assimilation of byproducts derived from ligninolysis. The result obtained show that Adh6p is responsible for the detoxification of this toxic products. Adh7p would help in this detoxification. The studies performed in oxidative stress conditions suggest that Adh6p is involved in oxidative stress response in yeast. We have also demonstrate that Adh6p is the enzyme responsible for the 3-methylbutanal reduction in yeast Finally, we have performed comparative studies between wild type and adh1? strains, that have demonstrate that Adh6p is involved in the NADP+/NADPH redox balance maintenance in yeast.