Regulación de la expresión de versicano y su relación con la diferenciación de las células de melanoma humano

Abstract

La composición de la matriz extracelular (MEC) determina algunos aspectos cruciales del comportamiento tumoral. Entre sus componentes destacan glicoproteínas y proteoglicanos (PGs), algunos de los cuales tienen receptores en la membrana celular. Nuestro grupo de investigación está interesado en la biología de los PGs en el melanoma humano. <br/>El VS es un PG de matriz de la familia de los hialectanos. Está formado por tres dominios: G1, G2 y G3. El splicing alternativo del dominio central G2 genera cuatro isoformas denominadas V0, V1, V2 y V3. <br/>En células de melanoma humano se ha descrito la expresión de proteoglicanos como el proteoglicano específico de melanoma (mel-PG), CD44 o versicano (VS), cuya presencia fue descrita en nuestro laboratorio. Asimismo, describimos su capacidad para incrementar la proliferación y migración en células de melanoma humano, además de disminuir su adhesión. <br/>En la primera parte de este trabajo determinamos el patrón de expresión de las isoformas de VS y de mel-PG durante el proceso de desdiferenciación de las células de melanoma, utilizando líneas celulares con diferentes grados de diferenciación (temprano, intermedio y tardío). <br/>Nuestros resultados muestran que el grado de diferenciación de las células determina la expresión diferencial de VS y mel-PG, de tal forma que las líneas celulares más indiferenciadas expresan todas las isoformas de versicano y las más diferenciadas ninguna de ellas. De ello concluimos que la pérdida del estado diferenciado se acompaña de la expresión de las diferentes isoformas de VS, hecho que parece ser común en tumores derivados de células con mismo origen embrionario, como muestran nuestros análisis preliminares realizados en células de neuroblastoma y astrocitoma. <br/>Durante el proceso de diferenciación in vitro de las líneas celulares SK-mel-1.36-1-5 y SK¬mel-3.44 estos PGs desaparecen, por lo que proponemos que la producción de versicano es señal de regresión a un estado no diferenciado durante la progresión tumoral, y que existe un patrón temporal para la expresión de cada isoforma de versicano. <br/>En la segunda parte analizamos la regulación del promotor de VS en líneas celulares de melanoma humano con grados de diferenciación temprano y tardío. <br/>Aislamos, secuenciamos y clonamos el promotor de VS humano. El análisis in silico del mismo determinó tres regiones de regulación: la primera en el extremo 5', presenta dos cajas de reconocimiento para TCF-4; la segunda en la zona central, 6 cajas de unión para Sp1, 7 para AP¬2 y una para Smad3/4; y la tercera en el extremo 3', una caja de unión para AP-1. <br/>Construimos diversos mutantes de deleción diseñados para aislar el papel de cada uno de los elementos reguladores del promotor de VS y los transfectamos de manera transiente en las líneas celulares. <br/>Los resultados muestran que TCF-4 es un activador responsable de más del 50% de la actividad total de este promotor, ya que la sobrexpresión de algunos de los participantes de la vía de señalización de TCF-4 tiene un efecto directo sobre la actividad del mismo. Además, mediante ensayos de EMSA determinamos la unión específica del complejo TCF-4/?-catenina. En la región central reside aproximadamente el 10% de la actividad total del promotor y hemos determinado la unión específica a 3 de los posibles sitios de unión para Sp1. Planteamos por tanto, que Sp1 es un modulador o quizás regulador de respuesta rápida de VS. Por último, en la región 3' del promotor, que contiene la secuencia de reconocimiento para AP-1, se encuentra el 40% restante de la actividad y hemos determinado que dicha secuencia es la responsable de la actividad basal de VS.

Extracellular matrix composition is crucial for some aspects of tumor behavior. Among its constituent factors, glycoproteins and proteoglycans play very important roles (some of which even having cell membrane receptors). Our research group is interested on proteoglycan biology in human melanoma. <br/>Versican is an extracellular matrix proteoglycan. It is a member of the hyalectan family and has three domains called G1, G2 and G3. The G2 central domain undergoes alternative splicing to generate four isoforms known as V0, V1, V2 and V3. <br/>The presence of proteoglycans such as the melanoma specific proteoglycan (mel- PG), CD44 or versican (VS), has been described in human melanoma cells. In our laboratory we have described VS presence in human melanoma cells and have showed how it increases cell migration and proliferation and how it diminishes cellular adhesion. <br/>In this work we first determined the expression pattern for both the four versican isoforms and mel- PG during melanoma cells desdifferentiation process. We used cell lines under early, intermediate and late differentiation degrees. <br/>Our results show that there is a close correlation between cell differentiation and either versican or mel-PG expression, in such a way that undifferentiated cells express all VS isoforms whereas the more differentiated express none. From this we concluded that the loss of a differentiated state is often accompanied by the expression of VS isoforms: our preliminary results using neuroblastoma and astrocytoma cells show that this might be a common fact among tumors originating from cells having the same embryonic origin. <br/>During in vitro differentiation, SK-mel-1.36-1-5 and SK-mel-3.44 cell lines loose these proteoglycans. For this reason we propose that versican production signals the regression to an undifferentiated state during tumor progression, and that there is a temporal pattern for the expression of each versican isoform. <br/>In this work we also analyzed versican promoter regulation in human melanoma cell lines under early and late differentatiation. <br/>We isolated, sequenced and cloned VS human promoter. Its in silico analysis showed that there are three regulation zones: 1) at the 5' end there are two recognition boxes for TCF-4. 2) In the central zone there are six binding boxes for Sp1, 7 for AP-2 and one for Smad3/4. 3) Finally, at the 3' end there is a binding box for AP-1. <br/>We also constructed several deletion mutants designed to study the role of each these regulating elements in the VS promoter. These were transiently transfected into the cell lines. <br/>Our results show that TCF-4 is responsible for more than 50% of the promoter's total activity as seen by the overexpression of some of the participants in the TCF-4 signaling pathway. Furthermore, through EMSA analysis we determined the specific union of the TCF-4/?-cathenine complex. The central region counts for roughly 10% of the promoter's total activity where we have determined the specific union for three of the possible Sp1 binding sites. For this reason, we postulate that Sp1 is a VS fast response regulator. Finally, the 3' region is responsible for the remaining 40% of promoter activity and we have determined that it is responsible for versican's basal activity.