Cid, la variant centromèrica de la histona H3 de Drosophila: mecanismes de deposició i anàlisi funcional

Abstract

El centròmer és una estructura especialitzada del cromosoma que té un paper fonamental en la correcta segregació cromosòmica durant la mitosi i la meiosi. Tot i que les histones es troben entre les proteïnes més conservades, una característica de la cromatina centromèrica és la presència d'una variant de la histona H3: CENP-A, la qual substitueix en els nucleosomes la histona H3 canònica tant in vitro com in vivo. Les variants centromèriques de la histona H3 (CenH3) es caracteritzen per tenir un domini C-terminal amb plegament tipus histona molt conservat i, en canvi, un extrem N-terminal que no mostra cap homologia significativa entre si, ni en tamany ni en seqüència.<br/>Es creu que CENP-A és el determinant epigenètic de la identitat centromèrica, sent la seva presència necessària per l'ensamblatge del cinetocor i per una correcta segregació cromosòmica. Ara bé, encara es coneix ben poc sobre el mecanisme pel qual CENP-A es localitza exclusivament als centròmers. Només es sap que la seva localització centromèrica requereix la presència de la regió L1/?2 del domini C-terminal i que la seva deposició és independent de replicació.<br/>En aquest treball mostrem com un mecanisme de degradació via proteosoma ajuda a la localització centromèrica de Cid, la variant de Drosophila melanogaster. Al sobreexpressar Cid sota el control del seu propi promotor, mitjançant transfeccions transients en cèl·lules Kc, s'observa com Cid és capaç de depositar-se al llarg de tota la cromatina. Ara bé, a mesura que avança el cultiu, aquesta localització es restringeix al centròmer. Assajos amb inhibidors del proteosoma i anàlisis de localització de Cid a mosques que presenten mutacions en subunitats del proteosoma, suggereixen l'existència, tant in vitro com in vivo, d'un mecanisme de degradació proteolítica que estaria regulant els nivells de Cid. Aquest procés deu ser necessari per tal que tingui lloc una correcta divisió ja que hem pogut observar que la majoria de cèl·lules amb Cid deslocalitzada estan aturades a G2 i presenten problemes de segregació cromosòmica.

The centromere is a specialized structure of the chromosome that plays a key role in the process of chromosome segregation during mitosis and meiosis. Although the histones are one of the most conserved proteins, one characteristic of the centromeric chromatin is the presence of a specific histone H3 variant: CENP-A, which replaces canonical histone H3 in nucleosomes, both in vitro and in vivo. The centromeric histone H3 variants have a well conserved histone fold domain and, in contrast, an N-terminal domain without any significant homology between them, neither in length nor in sequence.<br/>CENP-A appears to dictate centromere identity, being required for the kinetochore formation and for correct chromosome segregation. However, the precise molecular mechanisms accounting for the specific deposition of CENP-A at centromeres are not well understood. It is known that targeting to centromeres is mediated by the L1/?2 region of the histone fold domain and that its deposition is not linked to replication.<br/>In this work we show how a process of proteasome mediated degradation contributes to the centromeric localization of Cid, the histone variant of Drosophila melanogaster. Expressing Cid under the control of his own promoter, using transient transfections in Kc cells, can be observed how Cid is mislocalized along the chromatin. However, as cell culture progress, its localization is restricted to the centromere. Assays in the presence of proteasome inhibitors and studies of Cid's localization in Drosophila proteasome mutants suggest the existence, both in vitro and in vivo, of a proteolytic mechanism that regulates available Cid levels. This process seems to be required for a correct cell division since we have observed that cells showing mislocalized Cid are arrested in G2 and have strong segregation defects.