Estudios estructurales y caracterización de la unión al DNA del dominio C-terminal de la histona H1. Efecto de la fosforilación

Abstract

La histona H1 es la responsable de la condensación de la cromatina en la fibra de 30 nm. Se ha descrito que la H1 tiene preferencia por el DNA tipo SAR. Hemos mostrado que los subtipos H1a-e, H1º y H1t individualmente muestran preferencia por las SAR. La H1 está compuesta por 3 dominios: N-terminal, globular y C-terminal. El análisis independiente de los dominios mostró que el C-terminal determina la preferencia por las SAR de la H1. Las protaminas, relacionadas evolutivamente con la histona H1 y muy ricas en arginina también tienen preferencia por las SAR. La unión preferencial a las SAR del C-terminal y la protamina se pierde en presencia de distamicina, lo que indica que la interacción involucra el surco menor del DNA. La preferencia por las SAR está determinada por los bloques AT homopoliméricos. <br/>El dominio C-terminal de las histonas H1º (C-H1º) y H1t (C-H1t) se encuentra desestructurado en disolución acuosa, pero en presencia de DNA y 140 mM de NaCl se estructura completamente. La estructura secundaria obtenida está caracterizada por la presencia de hélice &#945;, estructura &#946;, giros y lazos abiertos. El TFE también induce estructura secundaria en los dominios C-terminales con características similares a las encontradas en los complejos con DNA. La estructura de los dominios C-terminales unidos al DNA es extremadamente estable. La desnaturalización de los dominios C-terminales unidos a DNA es cooperativa. El acoplamiento entre la unión al DNA y la inducción de estructura secundaria en el C-terminal permite incluir este dominio en el grupo de las proteínas intrínsecamente desordenadas que funcionan mediante el reconocimiento molecular.<br/>Las elevadas concentraciones de solutos macromoleculares en el interior de la célula hacen que una fracción importante del volumen intracelular no esté disponible. Los dominios C-H1º y C-H1t se estructuran en presencia de Ficoll 70 (30%) y el PEG 6000 (30%) por efectos del volumen excluido. La estructura secundaria inducida es similar a la encontrada en el C-terminal unido a DNA. Los resultados de SAXS indican que la compactación del C-terminal en presencia de aglomerantes macromoleculares es propia de un estado globular. La compactación va acompañada de la aparición de un núcleo hidrófobico. Sin embargo, el dominio C-terminal no está estructurado cooperativamente en presencia de agentes aglomerantes. Estas características indican que el C-terminal en presencia de agentes aglomerantes se encuentra en un estado de glóbulo fundido. La formación del glóbulo fundido en la célula aceleraría el paso al estado nativo o unido al DNA y facilitaría la difusión y el intercambio de la H1 en la cromatina.<br/>La histona H1 es fosforilada por las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Esta fosforilación es dependiente del ciclo celular con el máximo de fosfatos en la metafase de la mitosis. La mayoría de las dianas de las CDKs se encuentran en el dominio C-terminal. La fosforilación de los tres motivos TPXK del C-H1º induce un cambio estructural caracterizado por la disminución de la proporción de hélice &#945; y un aumento de la estructura &#946;. La magnitud del cambio depende de la relación proteína/DNA. A relaciones cercanas a la saturación la conformación de la proteína es del tipo todo-&#946;. La fosforilación de uno o dos de los tres sitios TPXK presentes en el C-H1º tiene efectos estructurales específicos. La fosforilación en T118 es la que afecta más profundamente la estructura con una disminución importante de la hélice &#945;, acompañada de la aparición de un porcentaje significativo de ovillo estadístico. <br/>La neutralización de la carga positiva de las lisinas por los grupos fosfato del DNA puede ser una de las causas principales de la estructuración del dominio C-terminal en los complejos con el DNA. A pH alcalino se induce estructuración en el C-H1º no fosforilado y trifosforilado, la cual refleja los cambios dependientes de fosforilación encontrados en los complejos con DNA.

H1 linker histones are thought to be primarily responsible for the condensation of the 30 nm chromatin fibre. Histone H1 preferentially binds to scaffold-associated regions (SARs). Here we show that the mammalian somatic subtypes H1a,b,c,d,e and H1_ and themale germline-specific subtype H1t, all preferentially bind to SARs. Experiments with the isolated domains show that whilst the C-terminal domain maintains strong and preferential binding, the N-terminal and globular domains show weak binding and poor specificity for the SAR. The preferential binding of SAR by the H1 molecule thus appears to be determined by its highly basic C-terminal domain. Salmine, a typical fish protamine, which could have its evolutionary origin in histone H1, also shows preferential binding to the SAR. The interaction of distamycin, a minor groove binder with high affinity for homopolymeric oligo(dA).oligo(dT) tracts, abolishes preferential binding of the C-terminal domain of histone H1 and protamine to the SAR, suggesting the involvement of the DNA minor groove in the interaction.<br/>The carboxyl-terminal domain of linker histone H1 subtypes H1º (C-H1º) and H1t (C-H1t) has little structure in aqueous solution but becomes extensively folded upon interaction with DNA. The secondary structure elements present in the bound carboxylterminal domain include &#945;-helix, &#946;-structure, turns, and open loops. The addition of TFE also induces secondary structure in the C-terminal domain that is very similar to the structure of the DNA bound. Examination of the changes in the amide I components in the 20-80 °C temperature interval showed that the secondary structure of the DNA-bound C-H1t is for the most part extremely stable. The H1 carboxyl-terminal domain appears to belong to the so-called disordered proteins, undergoing coupled binding and folding.<br/>In the cellular environment macromolecules and small molecule solutes are present at high concentrations so that a significant fraction of the intracellular space is not available to other macromolecules.The C-terminal domains C-H1º and C-H1t are significantly structured in the presence of Ficoll 70 (30%) and PEG (30%) The proportions of secondary structure motifs were comparable to those of the DNA-bound domain. The small-angle X-ray scattering showed that in crowding agents the C-terminus had the compaction of a globular state. Progressive dissipation of the secondary structure and a lineal increase in partial heat capacity (Cp) with temperature together with increased binding of ANS indicated that the C-terminus is not cooperatively folded in crowded conditions. These results indicate that the C-terminus in crowding agents is in a molten globule state. Folding of the C-terminus in crowded conditions may increase the rate of the transition toward the DNA bound state and facilitate H1 diffusion inside cell nuclei.<br/>Histone H1 is phosphorylated in a cell cycle-dependent manner by cyclin-dependent kinases (CDKs). The highest number of phosphorylated sites is found in mitosis. The majority of the phosphorylation sites for CDKs are located on the C-terminal domain. Complete phosphorylation of C-H1º is associated to a major structural change. This structural rearrengement implies the loss of almost all the &#945;-helix and a large increase in &#946;-structure. The extent of the conformational change appears to be dependent on triphosphorylation and the protein/DNA ratio. The final state of the structural change consists in an all-&#946; protein at ratios near saturation. Phosphorylation of one or two site have distintic structural effects. Phosphorylation of T118 affects the secondary structure the most, with a decrease of the &#945;-helix and the appearence of random coil.<br/>Charge neutralization provided by DNA phosphate groups is an important factor in the folding of the C-terminal domain of histone H1 when bound to DNA. Alkaline pH induces secondary structure in C-H1º unphosphorylated and triphosphorylated that reflects the structural changes associated to phosphorylation.