Identificación de genes implicados en la adquisición del fenotipo metastásico en modelos experimentales de cáncer de mama

Abstract

El cáncer de mama es una de las enfermedades más frecuentes entre las mujeres de los países desarrollados. La metástasis de los tumores es la principal causa de la muerte de un paciente con cáncer. Una de las maneras de abordar el estudio molecular y celular del proceso de desarrollo de las metástasis es la identificación de genes asociados al fenotipo metastásico.<br/>El método RAP-PCR (RNA arbitrarily primed PCR) consiste en dos reacciones consecutivas: una transcripción inversa del mRNA utilizando un cebador aleatorio y una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en que se emplea el mismo cebador más otro cualquiera. Con este método se pueden comparar simultáneamente fragmentos de DNA obtenidos aleatoriamente a partir del RNA de muchas variantes celulares con diferente capacidad metastásica. Si estos fragmentos, usados como sondas en análisis Northern, hibridan con RNA y se observan en cantidades relativas muy diferentes entre las distintas variantes celulares, se asume que los genes cuya expresión representan se expresan de manera muy diferente y pueden ser, por tanto, candidatos a influir en la aparición del fenotipo metastásico.<br/>En el presente trabajo, se ha empleado este método para el estudio de dos modelos experimentales de carcinoma de mama: uno de ratón (MXT) y otro humano (MDA MB-435). En ambos modelos existen variantes celulares con características invasivas y metastásicas bien diferenciadas.<br/>Los resultados obtenidos muestran que el método RAP-PCR permite detectar RNAs anónimos correspondientes a genes que se expresan diferencialmente en variantes de distinta capacidad metastásica, pero de acervo genético común.<br/>A partir de algunos de los fragmentos observados con expresión diferencial en los modelos tumorales MXT y MDA MB-435 (más de 50), se han identificado diversos genes. <br/>Los de mayor expresión en las variantes metastásicas fueron los correspondientes a enolasa, ESDN (endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like protein), S-adenosilhomocisteína hidrolasa, CHL1 (close homolog to L1CAM), Slmap (sarcolemmal-associated protein), eEF-1&#945; &#61472;(factor de elongación 1&#945;), Nono (non-POU domain-containing octamer-binding protein), moesina, eplin (epithelial protein lost in neoplasm), ADAMTS1, y a la proteína hipotética FLJ10830.<br/>Los de menor expresión en las variantes metastásicas fueron los correspondientes a la cadena &#946; de HLA-DP, la enzima E2 (variante 1) (ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1), y el gen denominado 7MXT en el presente trabajo.<br/>La función de estos genes puede adscribirse a alguna de estas categorías: metabolismo celular, regulación de la expresión génica, angiogénesis / diferenciación / invasión, proliferación celular; además, hay genes aún no identificados o de función todavía no conocida.<br/>El gen denominado 7MXT se encuentra en el cromosoma 11 del ratón, pero todavía no ha sido identificado. Su expresión está claramente disminuida en las variantes más metastásicas, pero se expresa en grado diverso en todos los órganos embrionarios de ratón en que se ha probado; la expresión más abudante corresponde al bazo y al corazón. En los ratones adultos sólo se ha detectado su expresión en el bazo y, sobre todo, en el ovario. <br/>La disminución de la expresión de ADAMTS1 hace aumentar la capacidad migratoria de las células tumorales B2 a través del colágeno IV (si bien no modifica la capacidad de adhesión de estas células a los distintos componentes de la matriz extracelular); además, aumenta el tiempo de latencia de crecimiento de los tumores primarios, pero no modifica la capacidad metastásica.<br/>Existe una conexión entre la aparición del fenotipo metastásico y la ausencia de expresión del gen de la cadena &#946; de HLA, una proteína del MHC-II que no se había asociado previamente con la metástasis. Además, la expresión de CIITA (transactivador del MHC-II), determina la expresión de MHC-II en las variantes metastásicas.

Breast cancer is one of the most frequent malignancies in women from developed countries. Tumor metastasis is the main cause of death in cancer patients. A useful approach to study the molecular and cellular process of metastasis development is to identify genes related to metastatic phenotype.<br/>RAP-PCR (RNA arbitrarily primed PCR) method consists of two consecutive reactions: a reverse transcription of mRNA usin an arbitrary primer and a polymerase chain reaction (PCR) using the same primer and any other one. With this method random DNA fragments obtained from RNA from many cell variants of different metastasic ability can be simultaneusly compared. When these fragments -used as probes in Northern blots- hybridize to real RNA and they are observed in different relative ammounts between the cell variants, the genes whose expression they represent are assumed to be differentially expressed and can be considered as candidates to be involved in metastasic phenotype development.<br/>In the present work, this method was employed to study two experimental models of breast carcinoma: a murine one (MXT) and a human one (MDA MB-435). Both models include cell variants with different invasive and metastatic abilities.<br/>The results show that RAP-PCR method let us detect anonyme RNAs corresponding to genes differentially expressed in cell variants of different metastatic ability, but sharing a common genetic background.<br/>Several genes were identified that showed differnetial expression in tumor models MXT and MDA MB-435.<br/>Those with a higher expression in metastatic cell variants were: enolase, ESDN (endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like protein), S-adenosilhomocystein hydrolase, CHL1 (close homolog to L1CAM), Slmap (sarcolemmal-associated protein), eEF-1&#945; &#61472;(elongation factor 1&#945;), Nono (non-POU domain-containing octamer-binding protein), moesin, eplin (epithelial protein lost in neoplasm), ADAMTS1, and hypothetic protein FLJ10830.<br/>Those with a lower expression in metastatic cell variants were: HLA-DP &#946;&#8722;chain, E2 enzyme (variant 1) (ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1), and the gene here called 7MXT.<br/>The function of these genes can be abscribed to one of the following cathegories: cellular metabolism, gene expression regulation, angiogenesis/differentiatio/invasion, cellular proliferation. Furthermore, several genes had not yet been identified or had an unknown function.<br/>The so-called 7MXT gene is located in chromose 11 in mice, but has not yet been identified. Its expression is clearly diminished in highly metastatic cell variants, but all of the tested embrionary organs express it in variable degree, and above all spleen and heart. Expression in adult mice has only been demonstrated in spleen and especially ovary.<br/>The decrease in ADAMTS-1 expression increases the migratory ability of highly metastatic tumor cells MXT-B2 through collagen IV (though no difference in adhesion ability to several extracellular matrix elements is observed); furthermore, ADAMTS-1 decrease increases latency in the development of primary tumors, without modifying the metastatic ability.<br/>There is a relation between the metastatic phenotype and the loss of expression of HLA-DP &#946;-chain gene -an MHC-II protein not previously associated to metastasis. Moreover, the expression of CIITA (an MHC-II transactivator) determines MHC-II expression in metastatic cell variants.