Structural studies on FF domains by NMR spectroscopy

Abstract

El present treball s'ha realitzat en el marc del Programa de Biologia Estructural i Computacional de l'IRB Barcelona, en el grup de RMN de proteïnes, sota la direcció de la Dra María J. Macías. L'interès del grup d'investigació se centra en la determinació estructural de dominis de proteïna, en l'estudi d'interaccions i en entendre els mecanismes per a la seva regulació. Concretament, aquest treball està enfocat en l'estudi estructural de dominis FF.<br/>En el nostre grup es va començar a estudiar els dominis FF a partir de l'observació que aquests dominis es troben sovint en proteïnes que també contenen WW, un petit domini d'interacció proteïna-proteïna que ha estat i continua sent la línia d'investigació principal del grup, i del qual s'han realitzat nombrosos i detallats estudis. <br/>En canvi, el dominis FF han estat identificats fa poc temps i la informació estructural i funcional de la qual es disposa és, a dia d'avui, escassa. En part, el pocs estudis realitzats amb aquests dominis pot ser conseqüència de que només els trobem en un conjunt reduït de proteïnes. De fet, la seva presència es limita a tres famílies de proteïnes: els factors d'splicing FBP11, Prp40 i URN1, el factor de transcripció CA150 i una família de proteïnes reguladores de RhoGTPases, les p190 RhoGAPs.<br/>Al meu grup, l'estudi amb dominis FF es va iniciar amb la resolució de l'estructura tridimensional del primer FF de la proteïna Prp40 de llevat, que va representar la segona estructura resolta per a un domini FF. En aquest treball l'objectiu ha estat aprofundir en el coneixement dels dominis FF, bàsicament des d'un punt de vista estructural utilitzant com a tècnica principal la resonànica magnètica nuclear (RMN). <br/>Aquesta tesi doctoral s'ha dividit en tres parts i en cada una d'elles s'ha treballat amb els dominis FF de les tres famílies de proteïnes esmentades anteriorment. L'enfoc també ha estat lleugerament diferent a cada part. Així, en el primer capítol, centrat en els dominis FF presents als factors d'splicing URN1 i Prp40, el gruix de la feina va ser l'obtenció de noves estructures tridimensionals per RMN d'aquests dominis. En canvi, en el segon capítol ens vam centrar en l'estudi de la interacció dels dominis FF de CA150 amb el seu primer lligand descrit, un motiu doble fosforilat del domini C-terminal de la RNA-polimerasa II (fosfo-CTD). Finalment, en la tercera part l'interès es va dirigir a l'estudi de la regulació de l'associació dels dominis FF de p190-A RhoGAP amb el factor de transcripció TFII-I, per mitjà d'una fosforilació sobre el primer FF de p190-A RhoGAP.

The present work has been done in the protein NMR group from the Structural and Computational Biology at the IRB Barcelona, under the direction of Dr. Maria J. Macias.<br/>The group's main interest is the structural determination of protein domains, in the study of their interactions and in the understanding of the mechanisms for their regulation. In particular, this work is focused in the structural study of FF domains.<br/>In our group, the study of FF domains began from the observation that these domains are often found in proteins that also contain WW domains, a small protein-protein interaction domain that has been, and continues to be the central research line of the group and that has been object of numerous and detailed studies.<br/>Conversely, FF domains have been recently identified and the structural and functional information available on them is, to date, limited. One of the reasons of the few studies reported for these domains could be consequence of their reduced presence in proteins. In fact, FF domains are only present in three protein families: the splicing factors FBP11, Prp40 and URN1, the transcription factor CA150 and a family of RhoGTPase regulators, the p190 RhoGAPs.<br/>In our group, the work with FF domains started with the solution of the three-dimensional structure of the first FF domain from yeast Prp40, which just represented the second solved structure for an FF domain. In the present work the aim has been to gain insight into FF domain knowledge, basically from a structural point of view, using nuclear magnetic resonance (NMR) as the principal methodology for the structural studies.<br/>This thesis has been divided in three parts, and in each of them we have work with FF domains from the different families mentioned above. The subject of study has been also slightly different in each part. In the first chapter, focused in FF domains present in Prp40 and URN1 splicing factors, the principal work consisted in the obtaining of novel three-dimensional structures for these domains by NMR. In contrast, in the second chapter the main interest was the study of the interaction of CA150 FF domains with their first described ligand, a doubly phosphorylated motif of the RNA polymerase II C-terminal domain (phospho-CTD). Finally, in the last part our efforts were focused in the study of the regulation of p190-A RhoGAP FF domains association with the general transcription factor TFII-I through phosphorylation on the first FF domain of p190-A RhoGAP.