El mecanisme de vigilància de la fase S estabilitza els nivells de la ciclina Clb6 en resposta a estrès genotòxic

Abstract

Les cèl·lules eucariotes estan constantment exposades a dany al DNA i a estrès replicatiu (estrès genotòxic), font d'inestabilitat genòmica. L'anomenat mecanisme de vigilància (checkpoint) de la fase S detecta la presència d'estrès genotòxic i genera una resposta que inclou l'aturada preventiva de la replicació i del cicle cel·lular, per tal de donar temps a la superació del problema, i la protecció de la replicació dels cromosomes. Quan els elements centrals d'aquest mecanisme de control estan mutants, les cèl·lules esdevenen genèticament inestables i, en humans, predisposa al càncer. <br/>Malgrat el seu paper crític en la preservació de la integritat del genoma, es desconeix la manera com el mecanisme de vigilància de la fase S executa bona part de la seva resposta. Els elements i vies que constitueixen el checkpoint estan conservats evolutivament. El nostre treball s'ha centrat en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae. En aquest organisme la proteïna quinasa efectora principal és Rad53. Amb l'objectiu de descobrir dianes a través de les quals Rad53 regula la fase S, s'han assajat en una reacció quinasa in vitro diferents proteïnes candidates a ser substrat de Rad53. Això ha permès la identificació de la ciclina de fase S Clb6 com a substrat de Rad53 in vitro.<br/>Les ciclines són les subunitats activadores de la quinasa dependent de ciclina Cdc28/Cdk1, que promou la progressió del cicle cel·lular. Cdc28/Cdk1 és activada per diferents ciclines específiques de les diferents fases del cicle cel·lular, que li confereixen especificitat de substrat. Clb6 és una de les dues ciclines de fase S (junt amb Clb5), que promouen la replicació del DNA. Mentre que Clb5 és present des del final de la fase G1 fins a anafase, Clb6 és eliminada durant la primera meitat de la fase S. <br/>Per tal d'estudiar si Clb6 és diana de Rad53 in vivo, s'ha estudiat el seu comportament en resposta a estrès genotòxic. Interessantment, en una fase S compromesa els nivells de Clb6 es mantenen estables, i aquesta estabilització és dependent de Rad53. <br/>Experiments amb l'inhibidor de la traducció proteica cicloheximida mostren que l'estabilització de Clb6 requereix síntesi de novo. Donat que en un cicle cel·lular no pertorbat Clb6 és expressada exclusivament en fase G1, sota el control del factor de transcripció MBF. Els nostres resultats indiquen que MBF es reactiva en una fase S compromesa: la subunitat transactivadora Swi6, exclosa del nucli en una fase S no pertorbada, és nuclear en una fase S compromesa; per altra banda, la sobreexpressió d'una forma hiperestable del repressor d'MBF Nrm1 dóna lloc a la desaparició de Clb6 malgrat la presència continuada d'estrès genotòxic i una resposta checkpoint funcional. Fins ara MBF era considerat un factor de transcripció exclusiu de la fase G1.<br/>Per últim hem explorat el paper de l'estabilització de Clb6 en una fase S compromesa. El mutant nul clb6 no presenta cap fenotip detectable, suggerint que Clb6 pot operar en forma redundant dins de la resposta a estrès genotòxic. Per aquest motiu hem optat pel plantejament complementari: estudiar l'efecte de mantenir la presència de Clb6 en una fase S no pertorbada (i per tant en absència de la resta de la resposta checkpoint). En aquestes condicions les cèl·lules repliquen el seu DNA amb aparent normalitat, però queden aturades en un estadi previ a anafase. Aquests resultats suggereixen que Clb6 pot ser un element efector de la branca S-M del mecanisme de vigilància de la fase S, que estaria constituïda per diversos punts de control solapat. Aquest paper justificaria que Clb6 hagi de ser eliminada de forma avançada respecte a Clb5.

Eukaryotic cells are permanently exposed to DNA damage and to replication stress (genotoxic stress), a source of genomic instability. A surveillance mechanism, the S phase checkpoint, detects and responds to genotoxic stress, and elicits a response that includes the arrest of cell cycle progression -to give time to overcome the insult- and the protection of chromosome replication. When the checkpoint central elements are mutated cells become genetically unstable, which in humans results in a high frequency of cancer.<br/>Despite such critical role to preserve genomic integrity, much remains unknown about the way how the S phase checkpoint executes its response. Because the checkpoint elements and pathways are conserved, our work has been carried out in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism Rad53 is the S phase checkpoint effector kinase. To identify novel Rad53 targets, we carried out an in vitro kinase assay with different potential substrate proteins involved in cell cycle control. This approach identified the S phase cyclin Clb6 as an in vitro Rad53 substrate.<br/>Cyclins are the activatory subunits for Cdc28/Cdk1, the cyclin dependent kinase that drives cell cycle progression in budding yeast. Cdc28/Cdk1 is activated by different cell cycle phase specific cyclins, that also confer substrate specificity to the kinase. Clb6 and Clb5 are the S phase cyclins, promoting the onset of DNA replication. Interestingly, whereas the presence of Clb5 spans from late G1 to anaphase, Clb6 is eliminated earlier, during S phase.<br/>To study whether Clb6 is a target of Rad53 in vivo, we explored the effect of genotoxic stress on the cyclin. When cells are exposed to replication stress or to DNA damage during S phase, the presence of Clb6 is stabilized, and such stabilization depends on Rad53.<br/>Experiments with the inhibitor of protein translation cycloheximide show that the stabilization of Clb6 requires de novo synthesis. In an unperturbed cell cycle Clb6 is expressed only during G1 phase, under the control of the transcription factor MBF. Our results show that MBF is reactivated in a compromised S phase: the transactivatory subunit Swi6, excluded from the nucleus in an unperturbed S phase, shows nuclear localization during a compromised S phase; in addition, the overexpression of a hyperstable form of the MBF repressor Nrm1 results in Clb6 elimination, despite the continued presence of genotoxic stress and a functional checkpoint response. To date, MBF was considered a transcription factor operating solely and characteristically during G1 phase.<br/>Finally we have explored the role of Clb6 stabilization in response to genotoxic stress. The clb6 null mutant does not present a detectable phenotype, which is compatible with a redundant role in the response to genotoxic stress. We therefore chose to address the question the other way round, and study the effect of keeping the levels of Clb6 stable during an otherwise unperturbed S phase (and therefore in the absence of the vast checkpoint response that could mask the specific role of Clb6). Under such conditions cells replicate normally, but arrest in a stage previous to anaphase. These results suggest that Clb6 may be an effector element in the S-M branch of the S phase checkpoint. One such role would explain why Clb6 must be eliminated in S phase, ahead of Clb5 during mitosis.