Portadores de reorganizaciones cromosómicas: segregación meiótica en espermatogénesis y consecuencias

Abstract

Desde el punto de vista metodológico esta tesis aporta, primero una mejora en la técnica de fusión heteróloga de ovocitos de hámster con esperma humano mediante el uso de ionóforo lo que mejora el proceso de capacitación espermática. En segundo lugar el uso de vinblastina, como agente antimitótico, es un hecho relevante que mejora sustancialmente la calidad de la extensión cromosómica y en consecuencia incrementa el número de complementos cromosómicos de mejor morfología para ser estudiados. Una tercera mejora importante ha consistido en un método original para el pintado de cromosomas enteros. Permite distinguir los complementos cromosómicos de ovocito de hámster de los complementos de pronúcleo masculino humano. Además, usando sondas de ADN marcadas con fluorescencia, específicas para los cromosomas preseleccionados, se han estudiado cromosomas humanos específicos. Esta aproximación metodológica mejorada hace posible estudiar con éxito la segregación meiótica en portadores de reorganizaciones cromosómicas equilibradas. Uno de ellos es la reorganización cromosómica compleja, 46, XY, -2, + der (2) t (2; 11) (q13; q23), - 11, + der (11) t (11; 22) (q23; q11.2), - 22, + der (22) t (2; 22) (q13; q11.2). Se analizaron un total de 208 complementos de esperma. La frecuencia de esperma que lleva una complemento normal o un complemento equilibrado era sustancialmente más baja que la frecuencia de espermatozoides desequilibrada siendo de 13,5% vs 86,5%, respectivamente, incluyendo 30 modos diferentes de segregación de ambos 4: 2 y 5: 1. Los resultados obtenidos en este estudio son compatibles con la formación, durante el proceso sináptico, de una figura hexavalente compleja que implica los cromosomas 2, 11 y 22. El comportamiento y la segregación de esta figura compleja explicarían la alta frecuencia (86,5%) de complementos desequilibrados observado en este portador. También se ha estudiado la segregación cromosómica de varios portadores de reorganizaciones cromosómicas. Tres portadores de translocacion recíproca (46, XY t (5; 7) (q21; q31), 46, XY, t (9; 17) (q12; p12) 46, XY, t (9; 17p13; q21.3) y un portador de inversión pericéntrica 47, XY, inv (7) (p13q36). En los portadores de translocaciones equilibradas se observaron todas los modos de segregación (alternante, adyacente-1, adyacente-2 y 3:1). No se ha observado relación entre la no disyunción de los cromosomas homólogos y las características particulares de la figura de emparejamiento, con la incidencia de eventos de recombinación meiótica en las regiones intersticiales de la estructura tetravalente. Además, en el caso del portador de la translocación recíproca 46XY, t (5; 7) (q21;q32) hay evidencia de un efecto intercromosómico, incremento de la frecuencia de aneuploidía en cromosomas no implicados en la translocación, con respecto a las muestras control. En cuanto a los portadores de inversiones pericéntricas analizados, el estudio de segregación cromosómica, proporciona una clara evidencia de una relación entre la incidencia de los productos de recombinación meiótica y la proporción entre el tamaño del segmento invertido respecto del tamaño total del cromosoma (tamaño en Mpb), más que con la longitud del fragmento invertido. Finalmente, cabe destacar la aplicabilidad de los resultados para desarrollar el conocimiento necesario para proporcionar un consejo genético apropiado a los portadores de reorganización cromosómicas equilibradas.

From the methodological point of view this thesis it provides, first the improvement of the heterologous fusion technique of hamster oocyte with human sperm by using ionophore improving the sperm capacitation process. Secondly using vinblastine, as antimitotic agent, improves the chromosomal morphology quality substantially, and consequently the number of complements good enough that can be studied increases. A third important improvement is an original method for painting whole chromosomes using FISH. It allows to distinguish both chromosomal complements, hamster oocyte chromosomes and human pronuclear male chromosomes. Moreover, using DNA probes labelled with fluorescence, specific to the preselected chromosomes, selected human chromosomes have been studied. This improved methodological approach enables study successfully meiotic segregation in carriers of balanced chromosomal rearrangements. One of them is the carrier of a complex chromosome rearrangement, 46,XY,-2, +der(2)t(2;11)(q13; q23),-11,+der(11)t(11;22)(q23;q11.2),-22, +der(22)t(2;22)(q13; q11.2). A total of 208 sperm complements were analyzed. The frequency of sperm carrying a normal or a balanced complement was substantially less frequent than the frequency of unbalanced sperm (13.5% vs 86.5% respectively) including 30 different segregation modes of both 4:2 and 5:1. The results obtained in this study are compatible with the formation, during the synaptic process, of a complex hexavalent figure involving chromosomes 2, 11, and 22. The behaviour and segregation of this complex figure would explain the high frequency (86.5%) of unbalanced complements observed in this carrier. Moreover sperm chromosome segregation studies in several carriers of balanced chromosome rearrangement are also performed: the following three reciprocal translocations (46, XY t (5; 7) (q21; q31), 46, XY, t (9; 17) (q12; p12) 46, XY, t (9; 17p13; q21.3) and the pericentric inversion 47, XY, inv (7) (p13q36). In the balanced translocation carriers the frequencies of alternate, adjacent-1, adjacent-2 and 3:1 segregation were detected. No relationship between the non-disjunction of homologous chromosomes and particular characteristics of the pairing figure such as the incidence of meiotic recombination events in the interstitial regions of tetravalent structure has been observed. Moreover, in the case of the carrier of t(9;17)(q12;p12) reciprocal translocation, evidence of an interchromosomal effect were observed, increased aneuploidy frequencies for chromosomes not involved in the translocation, in respect of control samples. Taking into account, the pericentric inversions carriers analysed, the chromosome segregation study provides a clear evidence of a relationship between the incidence of meiotic recombination products and the percentage of the inverted chromosome segment more tan with the length (size in Mpb) of the inverted chromosome segment. Finally, is worth noting the applicability of the results to develop the necessary knowledge, for proper genetic counselling to male carriers of balanced chromosomal rearrangements.