Nanophotonic biosensors for deciphering cell regulation pathways

Abstract

La presente Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de metodologías analíticas de carácter innovador para el estudio de diferentes rutas de regulación genética. Éstas nuevas técnicas de análisis se presentan como una atractiva alternativa para conseguir un diagnóstico y seguimiento de terapia del cáncer más precisos e informativos. Se propone el uso de un nuevo biosensor basado en tecnología nanofotónica como una plataforma ideal para el análisis rápido, directo y altamente sensible de dichas rutas, evitando el uso de marcadores o procesos de amplificación. Diferentes trastornos genéticos y epigenéticos asociados con la aparición y el progreso de cáncer han sido estudiados empleando ácidos nucleicos como marcadores biológicos. Para ello, se han empleado dos tipos de biosensores ópticos: (i) el conocido biosensor basado en Resonancia de Plasmón Superficial (SPR), y (ii) una nueva plataforma nanotecnológica altamente sensible basada en señales interferométricas producidas en guías de onda bimodal (biosensor BiMW). En primer lugar se ha llevado a cabo un estudio en profundidad de diversos procesos de biofuncionalización en ambas plataformas biosensoras. Se han optimizado diferentes procedimientos químicos de funcionalización de superficie de tal forma que aseguren una eficiente inmovilización de oligonucleótidos como elementos de biorreconocimiento. Esto ha permitido la detección de las secuencias diana de forma muy selectiva, ofreciendo la máxima sensibilidad y reproducibilidad posibles, especialmente para el análisis de muestras humanas complejas como son la orina o el suero. Una vez optimizadas las estrategias de biofuncionalización, se han evaluado diferentes rutas de regulación genéticas clínicamente relevantes como son los procesos de splicing alternativo, la regulación de micro-ARNs o los procesos de metilación de ADN. Todas las metodologías desarrolladas han sido evaluadas en términos de selectividad, sensibilidad y reproducibilidad, siendo validadas finalmente con el análisis de muestras reales. Las metodologías desarrolladas eluden inconvenientes críticos a los que se enfrentan normalmente las tecnologías convencionales empleadas para el estudio de estos procesos, ofreciendo protocolos más estandarizados que permiten una detección muy sensible, selectiva y con una mínima manipulación de la muestra. Este trabajo constituye el nacimiento de una nueva línea de investigación en nuestro grupo de investigación y combina nuestro amplio conocimiento en el desarrollo de innovadoras tecnologías biosensoras con nuestra gran experiencia en bioanalítica, ofreciendo finalmente herramientas de análisis muy avanzadas para la evaluación directa y efectiva de rutas de regulación genética como nuevas soluciones en el diagnóstico de cáncer y seguimiento de terapias.

This Doctoral Thesis focuses on the development of innovative biosensor devices as alternative analytical techniques for the evaluation of different gene regulating pathways in order to obtain a more informative and accurate diagnosis and follow-up therapy of cancer. We propose the use of a novel nanophotonic biosensor for a rapid, highly sensitive and direct analysis of these regulating routes without the need of labeling or amplification steps. Different genetic and epigenetic disorders associated with cancer appearance and progression are studied taking advantage of circulating nucleic acids as target biomarkers. For the label-free detection and evaluation of these biomarkers, we have employed two different optical biosensors: (i) the well-known Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor, and (ii) a novel nanotechnology-based interferometric device, the Bimodal Waveguide (BiMW) biosensor. First, an in-depth study of different biofunctionalization strategies on both platforms is presented. Several surface chemistry procedures have been optimized for an efficient immobilization of nucleic acids as biorecognition elements that ensure a highly sensitive target detection with maximum selectivity and reproducibility, especially for the direct analysis of complex human samples such as urine or serum. The optimized strategies were applied for the evaluation of specific and clinically relevant gene regulation pathways, such as RNA alternative splicing events, micro-RNA regulation, or DNA methylation processes. All the developed methodologies have been assessed in terms of selectivity, sensitivity and reproducibility, and in some cases, they have been validated with real samples. The obtained results overcome some of the critical drawbacks of the current methodologies employed for the analysis of such processes and offer standardized protocols for a highly sensitive and selective detection with minimal sample manipulation. The work in this Thesis has opened a new Research line in our Group and combines our wide knowledge in the development of powerful photonic biosensor technology with our bioanalytical expertise in order to offer advanced analytical tools for the direct and effective evaluation of gene regulating pathways as new solutions for cancer diagnosis and follow-up therapy