Structure and dynamics of a membrane symporter: The Melibiose Permease

Abstract

L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat estudiar el mecanisme de simport de la permeasa de melibiosa, MelB, un transportador secundari d’Escherichia coli, utilitzant mètodes experimentals (fluorescència, infraroig, assajos de transport) i computacionals (simulacions de dinàmica molecular). La MelB és un exemple de transportador versàtil, que pot utilitzar tant protons, com ions sodi o liti per a transportar una varietat de sucres α i β galactòsids. La MelB és una proteïna de 473 aminoàcids estructurats en forma de 12 hèlix transmembrana amb un 70% de residus hidrofòbics. Alguns estudis anteriors han demostrat que els bucles citoplasmàtics de la proteïna són importants per a la seva funció. Per tal d’avaluar la importància dels bucles perimplasmàtics, en el present treball hem analitzat el paper del bucle perimplasmàtic 5-6 (ric en glicines), juntament amb el paper d’uns pocs residus als extrems de les dues hèlix que connecta el bucle, la V i al VI, per mutagènesi dirigida. Els experiments de fluorescència (FRET) i d’infraroig (FTIR) han demostrat que les mutacions puntuals produeixen un efecte intermedi (50%) en la unió de substrats al transportador, exceptuant (i) els mutants Asp35 i Arg175/Asp35, que no uneixen substrat i (ii) els mutants Asn168 (bucle 5-6) i Phe177 (hèlix VI), que afecten en un grau elevat (més del 50%) la unió dels substrats. L’aproximació computacional ha permès concloure que alguns residus, com la Leu164 (hèlix V), l’Asn168 i la Phe177 juguen un paper important en el manteniment de la forma parcialment oclosa, interaccionant amb la meitat C-terminal de la proteïna. A més també s’han analitzat el paper de les interaccions iòniques. La informació obtinguda dels estudis de dinàmica molecular s’ha enriquit a partir de la troballa i descripció, per primera vegada, d’una forma de la proteïna oberta a l’exterior, resultat d’una trajectòria de 250 ns a partir de l’estructura cristal·logràfica. Els resultats indiquen que els residus Asp35, Asn168 i Phe177 tenen un paper important en el mecanisme de transport de la permeasa de melibiosa d’E. Coli.

The main aim of this doctoral thesis was to study the symport mechanism of the secondary transporter, melibiose permease (MelB) from Escherichia coli using experimental (Fluorescence, Infrared and transport assays) and computational (Molecular dynamics simulation) methods. This prokaryotic transporter is a versatile example of a cation-substrate cotransport carrier. A remarkable feature of this carrier is that, it uses different cations such as proton, Na+ or Li+ to transport variety of - and - galactosides. MelB is a protein of 473 amino acids arranged in 12 transmembrane helices with 70% of hydrophobic residues. Previous studies have shown the importance of cytoplasmic loops in MelB. Thus, in this study we analyzed the role of glycine rich periplasmic loop 5-6 along with few residues at the end and beginning of Helix V/VI, Asp-35 in Helix I by cysteine mutagenesis. Fluorescence (FRET) and infrared (FTIR) difference spectroscopy experiments have shown that the generated point mutations resulted in an intermediate (50%) effect on substrate binding, except for (i) the mutants Asp-35 and Arg-175/Asp-35, which did not exhibit any substrate binding, (ii) the mutants Asn-168 (loop 5-6) and Phe-177 (Helix VI), which had a high effect on substrate binding. The computational approach has pointed out that some of the residues, such as Leu-164 (Helix V), Asn-168, and Phe-177 play a significant role in maintaining the outward partially occluded conformation of MelB by interacting with the other half of the transmembrane helices, the C-terminal helical bundle. Furthermore, we also analyzed the role of ionic lock residues in MelB. The information derived from the molecular dynamics analysis has taken advantage of the description, for the first time, of an outward-open structure resulting from the crystallographic structure in a 250 ns trajectory. The results indicate that residues Asp-35, Asn-168 and Phe-177 have an important structural role in the transport mechanism of MelB.