Caracterització fenotípica i funcional de les cèl·lules T reguladores (naturals) en salut i malaltia (diabetis tipus 1)

Abstract

Les cèl.lules T reguladores naturals (nTregs) són limfòcits que es generen durant la selecció tímica i que formen part dels mecanismes que té el sistema immunitari per mantenir la seva homeostasi i controlar respostes autoreactives que poden conduir a l’autoimmunitat. Les nTregs són emigrants tímics que expressen de forma estable FOXP3, gràcies a canvis epigenètics que ocorren durant la seva maduració i que li permeten mantenir les funcions supressores. Les nTregs expressen també la cadena α del receptor de la IL-2, CD25 i això els hi confereix un fenotip activat. A més de CD25, les nTregs expressen altres marcadors com són: CTLA-4, GITR, CD127lo, CCR6, entre altres, i que són molècules que també s’indueixen en cèl.lules T activades durant la resposta. Tot i ser un marcador exclusiu al timus, l’expressió intracel·lular de FOXP3 el fa incompatible amb el seu ús per la purificació de les nTregs. Més endavant es va descriure que les cèl.lules T humanes activades també poden convertir-se en FOXP3+ i adquirir un fenotip supresor, tot i que la seva expressió és transitòria. Aquest fet, juntament amb l’absència de marcadors exclussius, fa que l’ús d’aquestes cèl.lules en immunoteràpia representi encara un repte. Per això, a partir de diverses aproximacions hem estudiat el fenotip de les cèl.lules T reguladores al timus i a la perifèria. De l´estudi exhaustiu d´una àmplia col.lecció de timus pediàtrics (n=35) d´edats compreses entre els 2 dies i els 8 anys, hem confirmat que la freqüència de les poblacions tímiques varia amb l´edat, tal i com s´havia descrit prèviament. A més, i per primera vegada, s´ha observat que la freqüència de les nTregs disminueix amb l´edat. El fenotip d´aquesta població és estable amb el temps, a excepció de CD95, membre de la familia del TNF involucrat en apoptosi i activació cel.lulars. La freqüència de cèl.lules CD95+ dins de la població de nTregs incrementa amb l´edat, i suggeriria un augment en susceptibilitat a l´apoptosi mediada per CD95 que explicaria la davallada d´aquesta població amb l´edat. Un cop les nTregs s´exporten des de timus a la perifèria, es barregen amb cèl.lules T activades i cèl.lules T de memòria amb les que comparteixen diversos marcadors. En el nostre laboratori vam abordar la cerca de molècules característiques de nTreg fent servir una aproximació proteòmica seguida d´una anàlisi d´expressió gènica. De la comparació de cèl.lules nTreg de timus i nTreg de perifèria vam definir la galectina3 com a marcador d´aquesta població que s´adquireix a perifèria. En cèl.lules Treg activades, funcionalment supressores, la seva expressió es troba a nivells similars de dos dels marcadors característics d´aquestes cèl.lules, FOXP3 i CTLA4. Finalment, es va abordar l´estudi d´aquesta població en pacients amb diabetes tipus 1. Es va fer un estudi exhaustiu de caracterització fenotípica en mostres de sang de pacients en comparació amb controls, que va revel.lar una disminució de GITR en les Tregs. Aquest defecte no afectava a la seva capacitat de supressió, en canvi podria estar associat a una major susceptibilitat a l´apoptosi.

Natural regulatory T cells (nTreg) are lymphocytes generated during thymic selection and are part of the mechanisms that the immune system uses to keep homeostasis and control autoreactive responses that can lead to autoimmunity. nTreg are thymic emigrants that stably express FOXP3 thanks to epigenetical changes that take place during its maturation, which allow them to maintain their supressor functions. Besides, nTregs express the alpha chain of the IL-2 receptor, CD25, which confers them an activated phenotype. Other Treg markers are CTLA-4, GITR, CD127low and CCR6, but they are also induced in activated T cells during the immune response. Despite being an exclusive marker in the thymus, the intracelular expression of FOXP3 makes it non compatible with its use for Treg purification. Later it was described that activated human T cells can also express FOXP3 and even acquire a suppresive phenotype, although transitory. This fact, together with the absence of exclussive markers, makes difficult the use of these cells in immunotherapy. Thus, using several approaches, we have studied the phenotype of these cells in the thymus and in the periphery. After studing a numerous cohort of paediatric thymus (n=35) from donors aged from 2 days until 8 years old, we confirmed that the frequency of thymic populations changes with age, as previously described. Also, and for the first time, we observed that nTreg frequency diminishes with age. The phenotype of this population is stable during time, except for CD95, a member of the TNF family involved in apoptosis and cellular activation. The frequency of CD95+ cells in nTreg population increases with age, which suggests a higher susceptibility to CD95-mediated apoptosis, and that could explain the decrease of nTreg with time. Once nTregs are exported from the thymus to the periphery, they are mixed with activated T cells and memory T cells with which they share several markers. In our laboratory we searched for characteristical Treg molecules using a proteomic approach followed by a genetic expression analysis. From the comparison of thymic nTreg and peripheral Treg we defined galectin 3 as a marker acquired in periphery by nTregs. In activated Treg, functionally supressive, galectin 3 expression is found at similar levels as those of FOXP3 and CTLA-4, very characterical Treg markers. Finally, we studied this population in type 1 diabetes patients. We carried out an extensive phenotypical study in PBMCs from patients compared to donors that revealed a diminished proportion of GITR+ cells among nTregs. This defect did not affect to their suppressive ability, instead could be associated to an increased susceptibility to apoptosis.